Жить Визуализация GFP-меченых белков в Drosophila Ооцитов

В этом протоколе циты, экспрессирующие белки, меченные GFP, препарируются у самок дрозофилы и визуализируются для изучения движения белка в живых клетках. Сначала подготовьте смотровую камеру, прикрепив два защитных стекла к предметному стеклу с помощью силиконовой смазки для формирования канала. Боковые стороны канала облицованы гало-углеродистым маслом.

Далее препарируйте яичники у самки в каплю гало-углеродного масла на покровном листе. Затем изолируйте отдельные циты и переверните покровную крышку над каналом в подготовленном предметном стекле, чтобы создать камеру для просмотра. После определения местоположения цитов с помощью светлопольной оптики или оптики DIC сделайте цифровые изображения через определенные промежутки времени с помощью конфокальной микроскопии и соответствующего программного обеспечения.

В конечном счете, покадровая последовательность полученных изображений может быть использована для мониторинга движения белков или частиц в живых клетках с течением времени. Этот метод может помочь в исследовании ключевых областей клеточной биологии и биологии развития, таких как транспортировка белков и мРНК, а также установление клеточной полярности. Сначала обезболите здоровых мух, возраст которых не превышает одной недели, и выберите от 10 до 15 крупных самок с округлым брюшком кремового цвета.

Переложите выбранных мух и нескольких самцов во флакон с новым слабо дрожжевым кормом. Затем инкубируйте мух в течение двух дней при температуре 25 градусов Цельсия до откорма. Откорм мух гарантирует, что различные стадии, особенно стадии с восьмой по 12, доступны для визуализации неоткормленных мух или плохо откормленных мух обычно содержат только очень ранние стадии и зрелые циты с использованием силиконовой смазки.

Прикрепите два защитных стекла на расстоянии примерно одного сантиметра друг от друга к стандартному предметному стеколу. Используйте только достаточное количество смазки, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между слипом крышки и ползуном. Сильно надавите на каждую крышку, чтобы распределить смазку тонким и равномерным слоем.

Затем добавьте немного hallow carbon oil 27 в место между защитными стеклами и слайдом, чтобы предотвратить повреждение изолированных цитов на последующих этапах. Теперь поместите две-три капли углеродного масла 27 на поверхность защитного стекла площадью 22 квадратного миллиметра. Далее в рот пипетки выводят отдельную самку из пищевого флакона и аккуратно помещают в ореол масло Карон.

С помощью острых рассекающих щипцов прижмите ширинку к покровному листу и оттяните кончик живота. Удалите завязи, проведя их по поверхности покровного стекла под маслом, чтобы способствовать сцеплению цитов с покровным листком. Теперь осторожно раздразните яичники в поисках цитов, которые находятся по крайней мере на стадии 10 B оогенеза.

Определите ооциты на этом этапе, ища яйцевые камеры, в которых яйцеклетки занимают не менее 50-60% от общего объема яйцевой камеры. С помощью щипцов. Удаляют отдельные ооциты из овиальной оболочки с помощью от одной до трех самок.

Продолжайте выделять пять-восемь неповрежденных ооцитов на покровном листе. Затем удалите все непригодные для использования ткани. Осторожно переверните покровное стекло, содержащее ооциты, на заранее подготовленное предметное стекло так, чтобы циты располагались между двумя спейсерами.

И помните, не нажимайте на крышку, так как это может повредить циты. При необходимости добавьте небольшое количество гало-углеродного масла по краям бутерброда, чтобы обеспечить заполнение пространства. Обратите внимание, что на этом этапе оогенеза фолликулярные клетки, лежащие над ооцитом, становятся коэрными и окружают ооцит со всех сторон, за исключением небольшой области, где остаются соединения с клетками-медсестрами. Сфокусируйте ооцит с помощью DIC или фазово-контрастной оптики.

Исследуйте ооцит на наличие признаков повреждения, таких как утечка цитоплазмы или выпячивание клеток фолликула. Визуализируйте только те ооциты, которые выглядят здоровыми и неповрежденными. Для непосредственного мониторинга потоковой передачи без маркировки GFP.

Установите изображения захвата в диапазоне ZI осциллографа с более высокими настройками усиления, чем те, которые используются для белков, меченных GFP. Использование воздушных мишеней для минимизации дрейфа и движения образца. Получите оптические срезы чуть ниже поверхности ооцита.

Как только интересующая область окажется в фокусе, выключите светлопольную оптику и переключитесь на конфокальную визуализацию с помощью функции быстрого предварительного просмотра сканирования программного обеспечения, при необходимости отрегулируйте фокус и усиление. Кроме того, задайте параметры возбуждения, длины волны и длины волны излучения. Для захвата по оси Z выберите постоянную ось Z с задержкой в 10 секунд между кадрами.

После захвата типичной последовательности таймлапсов от 20 до 50 кадров немедленно просмотрите и оцените качество видео. На этом снимке показана ооцит 11 стадии. Этот ооцит, экспрессирующий меченный GFP белок R TNL, может производить сильный сигнал.

R TNL one, по-видимому, локализуется совместно с длинными микротрубочками, присутствующими во время потока операционной плазмы. Как правило, поток оп-плазмы в яйцевой камере дикого типа проявляется в заметном движении автофлуоресцентных пузырьков YLK, как показано в максимальной проекции пятикадровой яйцевой камеры стадии 10 В. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять здоровые женские циты, экспрессирующие белки, меченные GFP, как готовить образцы для визуализации в реальном времени и как снимать покадровую съемку флуоресцентных белков и частиц.