Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Эта экспериментальная система предлагает высокопроизводительную методологию мониторинга цитотоксичности, опосредованной Т-клетками на уровне отдельных клеток. Сначала пометьте эффекторные Т-клетки и опухолевые клетки-мишени флуоресцентными красителями погибают. Загрузите оба типа ячеек в массивы нанолунок и погрузите весь чип в среду, содержащую зеленый цит и флуоресцентно меченный нексин. Пять.

Чтобы идентифицировать как некротические, так и апоптотические клетки, теперь запишите начальное предварительное изображение для определения заполненности лунки и жизнеспособности клеток в начале анализа. После шестичасовой инкубации запишите второе изображение. Затем используйте автоматизированный анализ изображений для количественной оценки антигенспецифического лизиса EL-четырех CD19-положительных Т-клеток с помощью авто-положительных Т-клеток.

Результаты, полученные с помощью этого высокопроизводительного метода, позволяют проводить скрининг антигенспецифического лизиса мишеней эффекторными клетками на основе положительного окрашивания цитотоксином. Пять. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как анализ высвобождения хрома-51, заключается в том, что можно достичь истинных эффективных взаимодействий мишеней один к одному и измерить частоту спутника. Применение этого метода распространяется на то, что лечится при раке, поскольку позволяет изучать корреляты эффективности в аутологичной клеточной терапии. Весовое соотношение 10 к одному в одноразовом стаканчике с помощью пластикового ножа. Дегазируйте смесь в вакуумной камере в течение одного часа.

Затем вылейте смесь на силиконовый мастер и оставьте на 30 минут. Теперь для отверждения эластомера нагрейте сборку в духовке при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух часов после охлаждения при комнатной температуре в течение часа. Осторожно снимите массив нанолунок PDMS с кремниевого мастера.

Накройте его скотчем до использования за сутки до начала эксперимента путем пропускания 5 миллионов клеток-мишеней в пять миллилитров. День проведения эксперимента. Гранулы 5 миллионов клеток в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров методом центрифугирования при давлении 340 G в течение пяти минут.

Аспирируйте избыток среды, оставляя после себя примерно 50 микролитров среды для маркировки клеток. Добавьте 150 микролитров свежего красного рабочего раствора Cell Tracker и тщательно перемешайте с помощью пипетки P 200, инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. С помощью гемоцитометра подсчитывают эффекторные клетки, собранные из культуры.

Затем гранулируют 5 миллионов клеток в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров методом центрифугирования. Отсасывайте избыток среды. Затем добавьте свежий рабочий раствор пяти микромоляров вибрирующего D цикла фиолетового окрашивания и суспензию с помощью пипетки P 200.

Инкубируйте клетки и умрите в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в дозе 6,8 мл и 6,0 мл R-P-M-I-P-L-G-H к клеткам-мишеням и эффекторным клеткам соответственно и перемешайте с помощью пипетирования. Затем медленно нанесите 3,5 миллилитров флаконной упаковки плюс на дно каждой пробирки, центрифугируйте обе пробирки при давлении 340 GS в течение 30 минут без перерыва и ускорения во время центрифугирования, подготовьте массив нанолунок Сначала перенесите семь миллилитров довоенного PBS на четырехлуночный планшет. Очистите дно предметного стекла этанолом с помощью плазменного окислителя.

Обрабатывайте PDMS при высоких настройках РЧ в течение 30–45 секунд. Затем поместите массив в PBS. Перенесите пластину в шкаф биобезопасности и отасуньте излишки PBS Нанесите теплый 1%-ный благородный агар на верхний и нижний края предметного стекла, чтобы обездвижить массив.

Убедитесь, что вы не даете PDMS высохнуть через 10 минут при трех миллилитрах PBS и аспирируйте избыток агара. Затем добавьте три миллилитра R 10 в верхнюю часть массива нанолунок и уравновешивайте в течение примерно 10 минут. После центрифугирования Фиала отсасывают пять миллилитров среды из верхнего слоя каждой пробирки.

Будьте осторожны, чтобы не отсасывать слой, содержащий клетки, с помощью пипетки P 1000. Соберите белый слой клеток между фиалом и средой. Переложите клетки в новые стерильные конические трубки.

Теперь дважды промойте собранные эффекторные и целевые клетки тремя миллилитрами довоенного R-P-M-I-P-L-G-H. После окончательного центрифугирования отасуньте излишки среды и повторно суспендируйте клеточную гранулу. В 500 микролитрах R10 подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью метода исключения трианового синего на гемоцитометре, отсасывайте избыток среды из массива нано.

Затем добавьте два миллилитра свежего аспирата R 10. Опять же, убедитесь, что верхняя часть массива nanowill не слишком влажная и не слишком сухая, так как это повлияет на распределение ячеек. Теперь внесите от одного раза по 10 до пятой части фекторных клеток в 200 микролитров R 10 на поверхность нановолового массива, что позволило клеткам осесть в течение пяти минут.

Затем с помощью стандартного микроскопа для тканевых культур проверяют желаемое распределение клеток. Затем нанесите один умноженный на 10 до пятой части клетки-мишени в 200 микролитрах R 10 на поверхность нанолуночного массива, содержащего эффекторные клетки. Через пять минут оцените распределение клеток с помощью микроскопии.

Затем тщательно промойте массив нанолунок двумя миллилитрами R 10 и отаскайте излишки среды в отдельной стерильной конической пробирке объемом 15 миллилитров. Пипеткой три миллилитра предварительно подогретого R 10 в трех микролитрах 0,5 миллимоляра цита, зеленого цвета нуклеиновой кислоты, и 60 микролитров X в пяти LOR 6 47 тщательно перемешать пипеткой. Теперь аккуратно пипеткой нанесите раствор красителя на четырехлуночный планшет, убедившись, что клетки не вытеснены из лунок инкубируются в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа получают изображения массива нанолунок с помощью флуоресцентного микроскопа типа zes observer Z one, оснащенного моторизованным столиком и Lambda DG четырех.

Инициализируйте программное обеспечение и микроскоп. Проверьте интенсивность сигнала на проходящем свете и других флуоресцентных каналах. Отрегулируйте настройку микроскопа так, чтобы обеспечить максимальное соотношение сигнал/шум, избегая при этом насыщения.

Теперь откройте список позиций x и Y для массива nelle. Установите нулевое положение XY и обнулите фокус в центре блока массива семь на семь нелле в верхнем левом углу штампа массива нелле. Установите положения XY так, чтобы они совпадали с центром каждого блока, а значение Z — так, чтобы точно отразить фокус на каждом блоке.

Теперь установите получение изображения в линейный режим и получите изображения. После первой серии визуализации верните массивы нанолунок в инкубатор для клеточных культур на шесть часов. Забота о возбуждении может привести к смещению клеток.

Затем повторите получение изображений во второй временной точке. Этот высокопроизводительный цитолитический анализ измеряет частоту антиген-специфического лизиса, меченных CD 19 специфическими CAR-положительными Т-клетками, инкубировали с мечеными мышиными EL-клетками четырех мишеней в отдельных лунках нано-L-массива. Гистограммы целевой ячейки представляют собой ямы, содержащие одну эффекторную ячейку и одну целевую ячейку.

После шести часов совместной инкубации согласованные гистограммы клеток-мишеней без эффекторов использовались в качестве отрицательного контроля для сообщения о частоте фоновой гибели клеток. Желательно достичь низких частот неспецифического лизиса в диапазоне от двух до 4%.Массив нанолунок может быть адаптирован для покадровой визуализации, чтобы обеспечить наблюдение эффектора, конъюгации мишени и последующей гибели клеток. Здесь немеченые автоположительные Т-клетки были совместно инкубированы с NA LM, шестью клетками-мишенями GFP в NOL и подвергнуты динамическому мониторингу.

Когда Xin 5 добавляли в питательную среду, апоптотические клетки помечали красным цветом. Эта техника может быть правильно выполнена через 10-12 часов после этой процедуры. Другие методы, такие как микрозахват, могут быть использованы для определения профиля секреции цитокинов в клетках.