C. Элеганс Анализ хемотаксиса
27 апреля 2013 г.
Метод количественной оценки хемотаксического ответа Caenorhabditis Элеганс Описан. Хемотаксическими индекс (СИ) был использован как способ точно оценить реакцию червей определенные цели, а также служить в качестве платформы для сравнения между штаммами и соединений, представляющих интерес.
Основной целью следующего эксперимента является количественная оценка хемотаксической реакции C elegance с использованием простого и недорогого метода анализа. Это достигается путем исолирования стадийных червей и размещения их в центре отмеченной пластины. На одинаковом расстоянии от всех тестовых и контрольных мест, отложенных на каждом месте, находится компонент интереса или контрольный компонент, оба из которых совместно с анестетиками, которые будут останавливать червей при их приближении.
Через 60 минут подсчитывается конечное распределение червей на пластине, и соотношение мест нахождения червей используется для предоставления индекса анализа. В конечном итоге, количественная оценка привлечения морских червей к определенным соединениям может быть использована для оценки поведенческих последствий базовых экспериментальных манипуляций. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она включает во многих полезных аспектах своих предшественников, обеспечивая в то же время большую простоту использования.
Этот анализ дает представление о поведении морских червей и особенно полезен в сочетании с нейрогенетическими манипуляциями и другими нейробиологическими анализами. Начните с пяти сантиметровых пластин, загруженных агаром хемотаксиса или NGM. Отметьте нижнюю сторону пластин на четыре равных квадранта.
Подготовьте по крайней мере три пластины для по крайней мере трех испытаний на каждую генетическую линию, испытываемую, и на каждое испытание условие. Затем отметьте круг радиусом 0,5 сантиметра вокруг начала координат. Затем отметьте точки в противоположных квадрантах с Т для теста или С для контроля, убедитесь, что места находятся на одинаковом расстоянии от начала координат и друг от друга.
Точки должны находиться не менее чем в двух сантиметрах от начала координат для этого анализа. Подготовьте молодых взрослых червей в синхронизированном развитии на пяти сантиметровых пластинах хемотаксиса. Черви, находящиеся на разных стадиях развития, могут по-разному реагировать на анализируемые вещества.
В результате очень важно, чтобы все черви, используемые в анализе, были на одной стадии развития. После того, как черви очищают луг OP 50 e coli, нанесите два миллитра базового буфера S на пластину. Манипулируйте пластиной, чтобы поместить всех червей в буфер для промывания червей.
Пипеткой наберите один миллиметр червей в буфере в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте их в течение 10 секунд. Используя пикофугу при 6600 об/мин, аспирируйте как базил, оставляя пеллет червей без разрушения. Теперь промойте этих червей еще три раза, используя тот же метод.
Начните с добавления буфера S в базил в пробирку и переверните пробирку, чтобы вернуть червей в раствор. После последнего промывания центрифугируйте червей еще на 10 секунд, а затем аспирируйте супернатант до конечного объема 100 микролитров. Затем убедитесь в достаточной плотности червей, нанеся два микролитра промытых червей из пеллета на пластину NGM.
Должно быть не менее 50 червей, но не более 250 червей. Если червей слишком много, увеличьте объем раствора ESP в базиле. А если червей слишком мало, отцентрифугируйте их и снова взвесьте их в меньшем объеме.
Поставьте пробирку с червями в дымоход. После приготовления черви готовы к использованию в анализе хемотаксиса в течение часа. Сначала приготовьте растворы.
Смешайте тестовый раствор, соединив равные объемы тестового соединения с анестетика 0,5 молярного азида. Затем смешайте контрольный раствор растворителя, используемого для разбавления тестового соединения, с 0,5 молярным натриевым азидом. Теперь приготовьте тестовую пластину.
Сначала нанесите два микролитра раствора червей из пеллета на начало тестовой пластины. Вторым шагом добавьте запахи, нанеся два микролитра тестового раствора на два сайта T и нанести два микролитра контрольного раствора на два сайта T. Как только черви и капли запаха были поглощены в агар, накройте крышки, переверните пластины и оставьте на 60 минут для времени анализа.
Для того, чтобы время диффузии ASI натрия стандартизировалось между испытаниями. Важно, чтобы червей добавляли немедленно до запахов.
Также каждая пластина должна быть полностью подготовлена и анализ начат до приготовления следующей пластины. После 60-минутного испытания поместите червей в холодильник при четырех градусах Цельсия. Позже, удалите пластину из холодильника, когда ее можно посчитать.
Не подсчитывая их немедленно и оставляя червей при комнатной температуре, можно позволить им мобилизоваться. Снова. Зафиксируйте местоположение червей, которые полностью вышли за пределы внутреннего круга из данных. Рассчитайте индекс
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье описан метод количественной оценки хемотаксической реакции Caenorhabditis elegans с использованием простого и экономичного анализа. Метод включает измерение распределения червей в ответ на различные соединения, обеспечивая хемотаксический индекс для сравнения.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая биология
- Экспериментальные анализы
Бакграунд
- Caenorhabditis elegans является модельным организмом, используемым для изучения поведенческих реакций.
- Хемотаксис является критическим поведением, которое может быть количественно оценено.
- Предыдущие методы были неточными и неудобными в использовании.
- Это исследование направлено на улучшение существующих методов оценки хемотаксических реакций.
Цель исследования
- Количественная оценка хемотаксической реакции C. elegans на различные соединения.
- Создание надежного хемотаксического индекса для сравнения различных штаммов и соединений.
- Упрощение оценки поведенческих последствий экспериментальных манипуляций.
Используемые методы
- Изоляция червей определенной стадии для тестирования.
- Размещение червей в центре отмеченной пластины.
- Равномерное размещение тестовых и контрольных соединений в сочетании с анестетиками.
- Подсчет распределения червей после 60 минут для расчета хемотаксического индекса.
Основные результаты
- Анализ эффективно количественно оценивает притягивающее действие червей на определенные соединения.
- Результаты предоставляют ясный хемотаксический индекс для сравнения.
- Метод демонстрирует простоту использования по сравнению с предыдущими техниками.
- Поведенческие последствия реакций червей могут быть оценены на основе результатов.
Выводы
- Разработанный метод предлагает надежный способ оценки хемотаксического поведения в C. elegans.
- Этот подход может улучшить понимание поведенческих реакций в различных экспериментальных контекстах.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения дополнительных соединений и условий.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantifying chemotactic responses in model organisms enables early-stage target validation by linking genetic or pharmacological manipulations to measurable behavioral outputs. This assay supports mechanistic de-risking in neuroscience discovery by providing a quantitative, reproducible readout for sensory pathway function. Its simplicity and scalability enhance predictive confidence in target engagement studies prior to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking gene function to sensory behavior in a whole-organism context.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative behavioral phenotyping.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by de-risking targets based on observable chemotactic phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs suitable for compound screening campaigns.
- Scalability: Four-quadrant design increases sample size and reduces bias, enabling reliable replicate testing.
- Workflow Integration: Allows unattended operation and endpoint scoring, improving throughput in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects genetic findings to behavioral outputs, supporting disease-relevant model validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway function through dose- and genotype-dependent chemotactic responses.
- Preclinical Alignment: Enables evaluation of behavioral consequences from target modulation in a genetically tractable system.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing a functional behavioral readout that informs target credibility.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying behavioral responses to compounds or genetic perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chemotactic indices that enable comparison across conditions and strains.
- Analytics: Generates a normalized chemotaxis index (−1 to +1) that facilitates data comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Links neurogenetic manipulations to phenotypic outcomes, supporting target-to-behavior translation.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, low-cost behavioral assay adaptable across multiple discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in behavioral phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized worm staging, plate preparation, and blinded scoring.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on functional behavioral data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying targets with strong phenotypic validation in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in worm handling, synchronization, and developmental staging.
- Depends on standard laboratory equipment including centrifuges, microcentrifuge tubes, and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of worm preparation and assay timing for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require adjustments to arena design and anesthetic compatibility.
- Practical limitations include sensitivity to worm density and developmental stage variability, which must be controlled.
