Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

Общая цель этой процедуры заключается в получении чистых культур астроцитов путем выделения и культивирования смешанных корковых клеток от P 1 до P 4 детенышей мыши. Это достигается путем предварительного забора коры головного мозга детенышей мышей и удаления мозговых оболочек. Второй шаг заключается в разрезании коры головного мозга на мелкие кусочки, диссоциации кусочков коры с помощью трипсина и тирования для получения отдельных клеток и нанесении одиночных клеток на колбы для культуры тканей, покрытых поли-де-лицином.

Затем, через семь-восемь дней, астроциты, микроглия и олигодендроциты образуют различные слои, и отделение астроцитов от микроглии и олигодендроцитов достигается путем встряхивания колбы с тканевой культурой на орбитальном шейкере. Последним этапом является ионизация и сбор оставшихся астроцитов, которые затем повторно помещаются в колбу для культуры тканей. В конечном итоге, через 12-14 дней после первого деления клетки, астроциты покрываются в соответствующей концентрации для экспериментов, и чистота клеток может быть исследована с помощью иммуноцитохимии с использованием специфических для астроцитов маркеров.

Описанный здесь метод основан на препарате культуры астроцитов из неонатального мозга грызунов, первоначально описанном Маккарти и разработанном в 1980 году. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как вопросы о взаимодействии между остеоцитами и нейронами, а также о роли остеоцитов при некоторых заболеваниях типа S, когда остеоциты активируются и способствуют образованию тормозных рубцов. Визуальная демонстрация этого метода полезна для молодых ученых, чтобы указать на критические этапы метода выделения и визуализировать морфологию астроцитов на различных этапах процедуры выделения для обеспечения чистоты и здоровья культур астроцитов.

Демонстрация этой процедуры будет проведена двумя аспирантами моей лаборатории, Себастьяном Хилкером и Кристианом Бора. Перед началом этой процедуры убедитесь, что все реактивы для культуры тканей и реагенты и материалы для рассечения заранее подготовлены в соответствии с инструкциями в письменном протоколе. После принесения в жертву щенка мыши от P one до P four выполните разрез по средней линии сзади вперед вдоль волосистой части головы, чтобы открыть череп, осторожно разрежьте череп от шеи до носа, затем сделайте разрез спереди от обонятельной луковицы и еще один ниже мозжечка. Чтобы отсоединить черепную коробку от основания черепа, используйте щипцы с плоским кончиком, чтобы аккуратно перевернуть черепные лоскуты в одну сторону.

Далее отрежьте обонятельные луковицы и мозжечок, а затем вытащите мозг. Поместите мозг в чашку с охлажденным HBSS и положите на лед. Теперь повторите процедуру, чтобы собрать мозги еще у трех животных.

Четыре мозга обеспечат достаточное количество астроцитов, чтобы засеять колбу с культурой тканей Т-75 с нужной плотностью. После того, как все мозги будут собраны, перенесите чашку с мозгами в стереомикроскоп. Затем, чтобы изолировать кору головного мозга, захватите задний конец каждого мозга тонкими щипцами и выполните разрез по средней линии между полушариями.

Затем вставьте второй набор щипцов в созданную канавку и отделите пластинчатую структуру коры головного мозга от остальной части мозга. После того, как все коры головного мозга будут изолированы, осторожно отсоедините мозговые оболочки от коры головного мозга, потянув за них тонкими щипцами. На этом этапе можно избежать контаминации окончательной культуры астроцитов менингеальными клетками и фибробластами.

Переложите подготовленные корковые полусферы во вторую посуду, наполненную охлажденным HBSS, и выложите на лед. Продолжайте соответственно со всеми четырьмя кортикальными отложениями. Наконец, разрежьте каждую полусферу на четыре-восемь небольших кусочков с помощью острых лезвий в стерильных условиях.

Переложите кусочки коры головного мозга в одну 50-миллилитровую соколиную пробирку и добавьте HBSS до конечного объема 22,5 миллилитров. Затем добавьте 2,5 миллилитра 2,5% трипса. Замените колпачок смесью и выдержите салфетку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Перемешивайте, встряхивая каждые 10 минут. Затем после центрирования в течение пяти минут при 300-кратном G до гранул. Кусочки ткани коры головного мозга тщательно сцеживают S-надосадочную жидкость.

Добавьте к грануле 10 миллилитров астроцитарной среды и с помощью пипетки объемом 10 миллилитров энергично пипетируйте среду, содержащую ткань, вверх и вниз от 20 до 30 раз до получения одноклеточной суспензии. Затем добавьте среду для покрытия астроцитов до конечного объема 20 миллилитров и подсчитайте клетки с помощью гемо или автоматического счетчика клеток. Согласно стандартным процедурам, один препарат из четырех коры детенышей мыши должен дать от 10 до 15 умножить на 10 шести диссоциированных одиночных клеток.

Наконец, аспирируйте поли-делицин из заранее приготовленной колбы и перенесите диссоциированную клеточную суспензию в колбу. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур в течение двух суток, а затем смените среду. Затем носители следует менять каждые три дня.

После этого астроциты должны стать дополненными вышележащим слоем микроглии через семь-восемь дней в культуре. На этом этапе установите колбу T 75 на орбитальный шейкер со скоростью 180 оборотов в минуту в течение 30 минут, чтобы удалить микроглию, выбросьте супинат, содержащий микроглию, или открутите его вниз и подготовьте к культивированию. Затем добавьте 20 миллилитров свежей питательной среды для астроцитов и продолжайте встряхивать колбу со скоростью 240 об/мин в течение шести часов, чтобы удалить клетки-предшественники олигодендроцитов.

Поскольку некоторые OPC не полностью отделяются от слоя астроцитов, продолжайте энергично встряхивать рукой в течение одной минуты. Чтобы предотвратить загрязнение OPC, опять же, выбросьте супинат или опустите его на планшет, чтобы культивировать OPC. Дважды промойте оставшийся сливающийся слой астроцитов с помощью PBS, аспирируйте PBS и добавьте пять миллилитров трипов в ЭДТА в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия.

Проверяйте отслоение астроцитов каждые пять минут и усиливайте отслоение астроцитов, ударяя колбу о ладонь два-три раза. Как только астроциты отделятся от колбы, добавьте пять миллилитров питательной среды для астроцитов. Вращайте клетки при температуре 180 G в течение пяти минут, аспирируйте супинат и добавьте 40 миллилитров свежего покрытия астроцитов. Терпимая.

Одна колба T 75 смешанных корковых клеток должна давать около одного цента из шести клеток, обогащенных астроцитами, после первого прохода клеток в двух колбах для культуры T 75 и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур. Меняйте среду каждые два-три дня, через 12-14 дней после первой массажной пластины, астроциты в соответствующей концентрации клеток за 24-48 часов до проведения эксперимента. Одна колба с культурой тканей T 75 должна дать от 1,5 до 2 умножить на 10 на шесть клеток после второго деления.

На этом изображении показаны смешанные корковые клетки через день после осаждения. Черные стрелки указывают на астроциты, прикрепленные к дну колбы. Умирающие нейроны можно увидеть плавающими в супинате через три дня после осаждения смешанных корковых клеток.

Формируется слой астроцитов, о чем свидетельствуют черные стрелки, а нейроны практически отсутствуют. Та же смешанная корковая культура наблюдается здесь через пять дней после нанесения покрытия. Первые микроглии и OPC на вершине слоя астроцитов видны, как показано черными стрелками, как показано здесь.

Слой астроцитов полностью сливается через семь дней после осаждения смешанных кортикальных клеток. На этом изображении показана обогащенная культура астроцитов. Через два дня после разделения.

Прикрепленные клетки демонстрируют морфологию астроцитов с низкой плотностью. Здесь области обозначают отдельные ячейки. Через две недели слой астроцитов достиг высокой плотности.

Масштабная линейка представляет собой 10 микрон. Это изображение демонстрирует чистоту культур астроцитов. На каждой панели зеленым цветом показаны клетки, которые были иммуноокрашены по маркерам астроцитов, G-F-A-P-G-L-A-S-T-S 100 B Aquaporin, четыре A LDH, один Lone и BLBP.

Ядра обнажаются с помощью противомерного окрашивания DAPI. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать и культивировать кортикальные астроциты. Выделение и культивирование кортикальных астроцитов, описанных в этом протоколе, является мощным инструментом для исследования биологии астроцитов.

Поскольку их управляемость в различных приложениях может значительно завершить их исследование in vivo.