Скрининг на Меланома Модификаторы помощью рыбок данио автохтонные модели опухоли

Общей целью данного эксперимента является скрининг модификаторов меланомы с использованием модели аутогенной опухоли рыбки данио. Это достигается за счет создания трансгенных животных, у которых меланоциты экспрессируют интересующий их ген, а рыбы предрасположены к меланоме. Затем оценивается начало меланомы, чтобы оценить, изменяет ли интересующий ген инициацию опухоли.

Затем проводится опухолевая инвазия и клеточно-специфические анализы, чтобы определить любое дополнительное влияние интересующего гена на меланомы и предраковые меланоциты. Наконец, клетки меланомы трансплантируются, чтобы измерить, как интересующий ген влияет на частоту возникновения меланомы, инициирующей клетки в установленных опухолях. Результаты показывают, как ген-кандидат влияет на различные свойства меланоцитов и меланомы, включая начало инвазии и способность к трансплантации.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как трансгенез зародышевой линии для обследования потенциальных генов рака, заключается в том, что экономится время, усилия и средства, а производительность увеличивается за счет анализа. Различные аспекты опухолегенеза у трансгенных животных Демонстрацией этой процедуры будет Шерания Агар, аспирант в моей лаборатории Для создания конструкций для инъекций. Начните с создания клонов шлюза с средним входом методом ПЦР, амплификации всей длины открытой рамки считывания интересующих генов и рекомбинации в P don R 2 21.

Затем используйте технологию многосайтовых шлюзов для рекомбинации интересующего меланоцитов специфического гена промотора mifa и сигнала полиаденилирования в мини-вектор Купера, чтобы поместить интересующие гены под контроль промотора mifa, введите 25 пикограмм каждого клона вместе с 25 пикограммами TOL two транспонирует мРНК в одну клетку трансгенных тройных гомозиготных эмбрионов данио-рерио. Mifa BRAF FP 53. Мутантные животные имеют дефицит меланоцитов и склонны к трансформации и образованию меланомы.

Вместе с интересующим его геном. Мини-вектор Купера содержит спасительный мини-ген MVA. Так успешно введенные животные разовьют спасенные меланоциты, которые экспрессируют интересующий их ген.

Инкубируйте введенные эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия через 24 часа после оплодотворения или HPF. Удалите все мертвые эмбрионы через 72 часа после оплодотворения с помощью препарирующего микроскопа под падающим светом на белом фоне. Отбор трансгенных животных с спасенными меланоцитами.

Когда животные достигнут четырех дней после оплодотворения, пересадите их в трехлитровые резервуары в питомнике питомника для рыбок данио. В возрасте двух месяцев выберите животных, у которых хотя бы одна область спасения меланоцитов превышает четыре квадратных миллиметра. Еженедельно проводите скрининг выбранных животных на наличие опухолей.

Изолируйте опухоленосных животных для исследования. Нарисуйте кривые выживаемости без меланомы с возрастом в неделях на absa и процентом выживаемости без меланомы на ординате. Сравните животных с меланоцитами, экспрессирующими ген, представляющий интерес, с контрольными животными, экспрессирующими EGFP и меланоциты.

Используйте логарифмический ранговый тест, чтобы определить, являются ли эти две кривые статистически различными. Провести анализ на инвазию опухоли. Начните с выбора изолированных рыб данио, у которых опухоли развиваются дорсально в области между задней границей заднего мозга и передней границей спинного плавника.

Через две недели после начала меланомы используйте трику для усыпления рыб после фиксации и погружения рыбы в парафин. Сделайте пять микрометров поперечных срезов через очаги поражения. Один. Каждые 50 микрометров прорезают все поражение, чтобы можно было определить точку самой глубокой инвазии.

Используйте гематин и эоин для окрашивания участков. Оцените инвазию опухоли путем измерения того, остаются ли опухолевые клетки за пределами коллагенового слоя, проникают в дорсальную мускулатуру или проникают дальше в позвоночный столб. Определите статистическую разницу между двумя наборами образцов для выполнения иммуноокрашивания.

Обезболивают рыб в дозе 0,17 миллиграмм на миллилитр трики с падающим светом под препарирующим микроскопом. Используйте острые щипцы с тонкими кончиками, чтобы выщипать спинную чешую. Соблюдая осторожность, чтобы не повредить меланоцит, содержащий половину чешуи.

Поместите чешуйки непосредственно из щипцов в один миллилитр фиксатора и инкубируйте при комнатной температуре, переворачивая более или равной двум часам. Пересадите рыбу в рыбьую воду и следите за ней, чтобы убедиться в успешном восстановлении до отбеливающих пигментированных меланоцитов. Сначала промойте неподвижную накипь в ПБСТ два раза в течение пяти минут при комнатной температуре.

Далее добавьте один миллилитр свежеприготовленного раствора отбеливателя и накройте отдушочными или колпачковыми замками, чтобы газ не лопнул трубки. Продолжайте отбеливание, пока пигмент не исчезнет. Затем стирать в PBST четыре раза в пять минут при комнатной температуре.

Инкубировать не менее 30 минут в блочном растворе, затем инкубировать с примерно 400 микролитрами первичного антитела и блочного раствора в течение ночи при комнатной температуре на следующий день, трижды промыть чешуйки в течение 30 минут в PBS при комнатной температуре, инкубировать со вторичным антителом в течение двух часов до ночи при комнатной температуре. Встав с dpi, нанесите каплю векторного щита на предметное стекло и установите весы так, чтобы вогнутая сторона весов была обращена вниз к предметному стеклу. Накройте образцы стеклянной крышкой.

Используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать края, и наблюдайте за предметными стеклами под флуоресцентным микроскопом. После облучения реципиента, двух-трехмесячная рыба Каспер подвергается 25 серым гамма-облучению за день до трансплантации. Дайте рыбе восстановиться в рыбной воде.

С помощью трики усыпить рыбу, несущую опухоль, отрезать опухоль и поместить ее в чашку Петри с примерно пятью миллилитрами фильтра, стерилизовать 0,9 XPBS с 5% FBS, бритвой нарезать опухоль, пока в растворе работать при комнатной температуре, и с помощью пипетки P 1000 итерировать до получения одиночных клеток. Доведите объем до 25 миллилитров. Отфильтруйте раствор через сетчатый фильтр 40 микрометров и вращайте в настольной центрифуге при 453 RCF в течение 10 минут.

Повторно суспендируйте гранулу в 0,9% PBS 5% FBS до желаемой концентрации. С помощью гемоцитометра рассчитать точное количество клеток и развести клеточную суспензию так, чтобы итоговый объем инъекции составил примерно пять микролитров. Например, если необходимо ввести 50 000 клеток, клеточную суспензию следует разбавить до конечной концентрации 10 000 клеток на микролитр.

Каждые несколько минут переворачивайте пробирку, содержащую клеточную суспензию, чтобы предотвратить слипание клеток, со 100% этанолом и 0,9 XPBS. Промойте конический наконечник калибра 26 с 7, 0, 1 и 10 микролитров Hamilton два-три раза перед загрузкой шприца пятью микролитрами клеточной суспензии. После обезболивания облученной рыбы-реципиента в трику, положите ее на бок на влажную салфетку Кима.

Стабилизируйте рыбу одной рукой и введите иглу скосом вверх под углом 45 градусов в бок рыбы над брюшной полостью. Примерно на полпути между задней границей заднего мозга и передней границей спинного плавника. Аккуратно нажмите на поршень.

Дайте рыбам восстановиться в пресной рыбной воде и ежедневно наблюдайте за рыбами на предмет приживления опухоли. Если приживление произошло, также может наблюдаться дальнейший рост и развитие болезни. Эмбрионам данио-рерио с одной клеткой BRAF FP 53 MIFA вводили мини-вектор Купера, содержащий набор онкогена меланомы DB one или EGFP каждый под контролем промотора MFA, как показано здесь.

Кривые заболеваемости опухолями у взрослых показали, что SET DB one значительно ускоряет возникновение меланомы по сравнению с контролем EGFP, как видно здесь, окрашивание гематином и EOSIN показывает, что меланомы, экспрессирующие SET DB one, были более локально инвазивными, чем меланомы контроля EGFP. На этом рисунке показаны обесцвеченные или неотбеленные чешуйки данио-рерио, которые были окрашены антителом, распознающим ядерный локализованный фактор транскрипции mifa для оценки трансплантатной способности опухоли. Клетки меланомы были выделены из рыбы BRAF FP 53 mifa, которой ввели мини-чашку R-E-G-F-P 50, 000 клеток были подкожно введены мутанту-реципиенту Casper, который был облучен накануне 25 серыми цветами, как это видно на примере двухнедельного возраста.

Пигментированные клетки, полученные от доноров, были легко узнаваемы. Таким образом, после своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии рака к изучению функциональных последствий генетических изменений, связанных с меланомой, с использованием рыбок данио. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить скрининг модификаторов меланомы с помощью анализа, различиях в начале инвазии опухоли, экспрессии генов и способности к трансплантации с использованием модели автоопухоли рыбки данио.