Экспериментальные методы изучения влияния Нейротрофических пептида ADNF-9, против пьянства-индуцированного апоптоза в период беременности у мышей C57BL / 6

Целью данной процедуры является оценка нейропротекторных эффектов трофических пептидов на модели воздействия алкоголя на плод. Это достигается путем спаривания экспериментальных животных, а затем обработки беременных самок трофическими пептидами в качестве второго этапа, плод препарируется для выделения мозга плода для экспериментального использования. Затем мозг плода встраивают в желатин для разрезания, после чего проводят туннельное окрашивание для определения результатов гибели клеток.

Это показывает, что пренатальное воздействие алкоголя увеличивает количество туннельных положительных клеток в ганглионарном возвышении. По сравнению с контрольной группой, при введении трофического пептида, A D и F 9 значительно снижали индуцированное алкоголем увеличение туннельных положительных клеток по сравнению с контрольными животными, получавшими алкоголь. Таким образом, визуальная демонстрация этого металла имеет решающее значение, поскольку вскрытие мозга плода и встроенные шаги трудно освоить, потому что мозг плода очень мал для препарирования и обработки для разрезания шести мышей первой породы C 57 путем помещения шестинедельных самок мышей весом около 20 граммов в домашние клетки самцов на два часа сразу после удаления.

Проверьте каждую самку на наличие сперматозоидной пробки, чтобы подтвердить, что спаривание произошло. Если сперматозоидная пробка присутствует, то обозначьте этот эмбриональный нулевой день на Е семь вес, сопоставьте беременных самок на четыре группы. Одна группа жидких диет с алкоголем обеспечивала свободный доступ в качестве единственного источника питательных веществ.

Две контрольные группы лечения тремя пептидами, которые должны получать внутрибрюшинную инъекцию пептида DNF 9 одновременно с воздействием алкоголя. Жидкая диета. Запишите объем жидкого рациона, потребленного животными за 24 часа, из 30-миллилитровых градуированных пробирок с винтовой крышкой, чтобы определить суточное количество алкоголя, жидкого рациона или парного жидкого рациона, которое может быть обеспечено за счет свободного избытка в качестве единственного источника питательных веществ.

Следите за тем, чтобы свежеприготовленная жидкая диета подавалась ежедневно с Е 7 до Е 13 после принесения в жертву беременной Майер Е 13 путем усыпления углекислого газа с последующим вывихом шейки матки. Уложите тушу на доску для вскрытия в лежачем положении и очистите брюшную полость 70% этанолом. С помощью стерильных ножниц и щипцов сделайте разрез на брюшной полости.

Как только брюшная полость будет открыта, удерживайте матку щипцами и используйте вторые щипцы, чтобы медленно и осторожно оторвать эндометрий от матки, не прокалывая эмбрионы. Осторожно извлеките эмбрионы из матки и перенесите их в сортировочный раствор Hank's Balance В чашке для клеточной культуры размером 60 на 15 миллилитров на влажном льду поместите чашку и контейнер со льдом на столик стереомикроскопа с помощью ультратонких щипцов для микродиссекции. Снимите кожу с эмбрионов в верхней части головы, чтобы обнажить череп.

После того, как череп обнажен и четко визуализирован под стереомикроскопом, захватите основание черепа на уровне спинного мозга и ствола головного мозга с помощью щипцов и начните отслаивать череп. Продолжайте отслаивать череп по частям от задней части головы к передней. Как только мозг будет полностью открыт, используйте щипцы для его извлечения.

Затем рассеките мозг плода от основания первичной или фабричной луковицы до основания Met Postfix весь расчлененный мозг плода в 4% паральдегиде в течение двух-трех дней. Мозг плода также может быть заморожен при тестировании его на вестерн-блоттинг или ферментативные анализы. После приготовления 10%-ного раствора желатина марки А, приготовленного в дистиллированной воде, заполните закладную форму для снятия кожуры наполовину и подождите, пока желатин застынет.

Поместите контрольный и пренатально обработанный мозг плода рядом друг с другом поверх затвердевшего желатина. Это необходимо для поддержания одинаковых условий между контрольной и экспериментальной группами. Убедитесь, что желатин не слишком горячий, и добавьте жидкий желатин поверх мозга плода, чтобы получилась полная форма.

Окончательная форма должна напоминать это изображение, охладите подготовленную желатиновую форму, которая удерживает мозги плода, на 15 минут. Далее снимите с закладной формы пластик. Окончательная форма должна выглядеть так, а затем перенести желатин, содержащий мозги плода, в 4% паральдегид на двое суток.

На третий день прикрепите желатиновый блок, содержащий неподвижный мозг плода, к стадии виома. Затем разрежьте мозг с помощью набора виомов толщиной от 25 до 50 микрон для коронального разрезания. Соберите срезы мозга плода в PBS, затем закрепите срезы мозга плода на суперморозах и горках в воде и дайте им высохнуть в течение 15 минут.

По прошествии 15 минут. Поместите предметные стекла в PBS для тестирования туннельной реакции на следующий день. Сначала погрузите предметные стекла в раствор 20 микрограммов на миллилитр протеиназы К и PBS на пять минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем промойте три раза в PBS по пять минут каждый на орбитальном шейкере. Инкубируйте секции с 3%-ной перекисью водорода в метаноле в течение 10 минут при комнатной температуре без встряхивания. Затем вымойте горки, как и раньше.

Далее инкубируйте секции в проницаемом растворе в течение двух минут на льду. После инкубации дважды промывают в ПБС. Как и раньше, используйте лабораторную салфетку для сушки области предметного стекла вокруг секций.

Затем с помощью похлопывающей ручки нарисуйте вокруг секций на слайде. Это предотвращает вытекание раствора для окрашивания, что позволяет использовать небольшой объем. Инкубировать по одной секции в каждой паре туннельной реакционной смесью, приготовленной в соответствии с инструкцией производителя.

Добавьте раствор-носитель без туннельного реагента в секцию отрицательного контроля. Затем выдерживайте предметные стекла в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. По истечении времени инкубации трижды промойте предметные стекла в PBS на орбитальном шейкере, как и раньше.

Затем высушите участок вокруг ткани лабораторной салфеткой. Далее инкубируйте секции с раствором конвертера POD в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания. Затем промойте секции три раза по пять минут каждая с трисом гидрохлоридами.

Переложите предметные стекла в держатель и поместите их в банку с коплином, содержащую 0,05% DAB и 0,003% перекиси водорода. Накройте банку алюминиевой фольгой и поставьте ее на орбитальный шейкер на лед на семь минут после инкубации, промойте PBS, как и раньше, при желании. Слайды могут быть сохранены в PBS до того, как они перейдут к окрашиванию счетчика ракет, как подробно описано в текстовой части протокола.

На следующих изображениях показаны эффекты нейротрофического пептида A DNF 9 против алкоголь-индуцированного апоптоза с использованием туннельного анализа в ганглионарном возвышении, поскольку пренатальное воздействие алкоголя на стадии E 13 увеличивает гибель клеток, на что указывают стрелки в группе A LC по сравнению с группой PF. Введение 9-го витамина D nf наряду с пренатальным воздействием алкоголя индуцировало снижение количества туннельных положительных клеток. Статистический анализ показал, что введение AD и F9 предотвращает вызванное алкоголем увеличение туннельных положительных клеток.

Значения отображаются в виде средних плюс минус стандартная ошибка среднего значения. Одна звездочка указывает на значение P меньше 0,052. Звездочка указывает на значение P менее 0,01 по апостериорному тесту Ньюмана Коулза.

Каждая группа содержала N из четырех. Таким образом, после его разработки, этот метод для исследователей и специалистов в области развития мозга позволяет исследовать эффекты лекарств или соединений и развитие мозга у мышей.