Простой и эффективный способ для подготовки яичек клеточные суспензии

В этом видео будет представлен очень простой и эффективный протокол получения клеточной суспензии тестового материала от грызунов всего за 15 минут. Метод был применен для тестирования на мышах, крысах, морских свинках и использует метамашинное устройство для дезагрегации инкапсулированной ткани. После фильтрации и окрашивания ячейка готова к потоку.

Анализ цитов или сортировка Гомогенность клеточных популяций является предпосылкой для анализа биохимических и молекулярных событий при дифференцировке ГА у самцов. Таким образом, гетерогенность яичек с более чем 30 различными типами клеток представляет собой одну из основных проблем изучения молекулярных основ сперматогенеза млекопитающих. По этой причине для получения обогащения до очищенных популяций клеток яичка были использованы различные методы, включая ПУ и центробежную иллюстрацию.

Первым этапом для любого метода разделения клеток является приготовление клеточной суспензии. Тем не менее, современные протоколы обычно занимают много времени и могут означать потерю короткоживущих молекул, таких как РНК, что нежелательно для анализа скрытой экспрессии. Основное преимущество представленного здесь протокола заключается в том, что он исключает этапы между умерщвлением животных и стадией молекулярных исследований сперматозоидов, но в то же время обеспечивает хорошее качество и превосходную репрезентацию типов клеток в клеточных суспензиях.

Демонстрировать процедуру будет доктор Ана Родригес, научный сотрудник лаборатории AL, которая разработала метод, и проточная цитометрия Федерико Сан Лопеса, которая отвечала за цитометрический анализ. Для процедуры требуется небольшое оборудование, система meach, с ее медицинскими и fcon-аксессуарами. Однако аксессуары fcon можно прекрасно заменить нейлоновыми мембранами того же размера пор.

Единственными другими необходимыми материалами и реагентами являются стеклянная паста, две посуды, ножницы и щипцы, шприц объемом от трех до пяти миллилитров для раздражения кишечной камеры, питательная среда DMM с добавлением 10% фетальной сыворотки от кашля и NDA. Если планируются последующие приложения, включающие манипуляции с РНК, то все материалы и растворы должны быть обработаны соответствующим образом для выполнения протокола. Поместите рассеченное яичко в 96-миллиметровый стакан со льдом, содержащим 10 миллилитров добавленного льда, называемого dm.

Удалите TAL Virginia, разрежьте семенник на квадратные кусочки по два-три миллиметра с каждой стороны. Поместите четыре-пять таких кусочков в одноразовый десегрегированный препарат вместе с одним миллилитром кода с добавлением D и обработанным в системе мета-машины в течение 50 секунд. Каждый медицинский блок содержит неподвижный экран из нержавеющей стали с примерно сотней шестиугольных отверстий, окруженных шестью микролезвиями.

Ткань подается к каждому отверстию металлическим ротором внутри медицинской камеры и десегрегируется, проходя через заточенные отверстия и через металлический экран, в то время как микронасос под решеткой подает жидкость и промывает корпуса. Восстанавливают результат в клеточной суспензии из медика с помощью трех-пятимиллиметрового шприца без иглы. Впоследствии пропитайте сокол 50 микрометров или такую же четырехмерную капроновую сетку половиной миллилитра среды и отфильтруйте через нее суспензию.

Повторите этот шаг, но с помощью нейлоновой сетки толщиной 25 микрометров или аналогичного соколиного устройства и положите его на лед, возьмите цитату ALI клеточной суспензии для подсчета в камере Нойера и отрегулируйте концентрацию клеток в соотношении один-два раза по 10 до семи клеток на миллилитр в питательных средах. Наконец, добавьте NDA в конечную концентрацию 0,2%, чтобы избежать накачки клеток, а также избежать закупорки мышц во время последующих исследований потока. Если предполагается оценить жизнеспособность клеток, это можно сделать с помощью набора для жизнеспособности живых клеток животных, следуя инструкциям производителя перед проведением проточного цитометрического анализа, добавив флуоресцентный краситель.

Выбор флуорохрома будет зависеть от доступных лазеров. В этой демонстрации будет показано использование различных красителей, которые связывают документ с ДНК. Хотя пропидиум йо диета является обычным красителем для фиксированных или мертвых клеток в низких концентрациях, мы обнаружили, что при использовании в высоких концентрациях ROM проникает в нефиксированные клетки яичек в суспензии, приготовленные представленным здесь методом.

Вероятно, это связано с подразумеваемым механическим напряжением, которое в сочетании с сенсорной природой полуэпителия может привести к разрыву межклеточных соединительных мостиков с минимальными манипуляциями Для окрашивания пропидиума йодидом за 10 минут до анализа образца в раствор при конечной концентрации 50 мкг на миллилитр в клеточную суспензию и инкубации при нулевом градусе Цельсия в темноте Для анализа пропидиума мю окрашивание клеток. Для дальнейшей сортировки мы используем факсимильный проточный цитометр, оснащенный когерентным лазером на ионах таргона, настроенным на излучение на 488 нанометров. Мощность лазера устанавливается на сто милливатт, а излучаемая флуоресценция пропидия I собирается детектором FL two с помощью фильтра полосы пропускания 5 7 5 5 слэш 26.

Используйте сопло 70 микрометра для измерений проточной цитометрии и программное обеспечение squa для анализа следующих параметров. Прямое рассеяние на стороне рассеяния, общая площадь излучаемой флуоресценции или импульса и продолжительность флуоресцентного излучения или длительность импульса. Результаты представлены в граммах, представляющих количество событий на каждом уровне флуоресценции, и в виде D-графиков, отображающих боковое рассеяние в зависимости от площади флуоресцентного импульса и площадь флуоресцентного импульса в зависимости от его ширины.

Дублеты исключены из анализа с помощью графиков DO зависимости площади флуоресцентного импульса от его ширины для сортировки популяций моноцитов SM с заданным факсом режимом сортировки в нормальном R или нормальном C и используют три отсортированные капли в качестве конверта. Регулируйте дифференциал образцов для анализа ячеек со скоростью от 500 до 1500 в секунду. Держите пробирки для отбора проб и сбора при температуре от трех до четырех градусов Цельсия с помощью холодильной установки.

В качестве альтернативы, клетки в суспензии могут быть окрашены другими флуорохромами. Например, жизненно важный краситель. HER 3 3 3 4 2 можно использовать до конечной концентрации пять микрограммов на миллилитр и инкубировать не менее 10 минут при температуре 37 градусов в защищенном для Хирша свете.

3, 3, 3, 4, 2 пробы. Анализ клеток проводился с помощью проточного цитометра MO, оснащенного лазером с ультрафиолетовым возбуждением, работающим на длине волны 25 милливатт, и соплом 70 микрометров. Используйте программное обеспечение Summit 4.3 или аналогичное для анализа тех же параметров, которые были указаны ранее при анализе суспензий клеток, при этом наблюдается контраст лица, оптика, качество разреза.

Основными преимуществами этого протокола являются, во-первых, суспензии клеток яичка, приготовленные с помощью многих аппаратов и получение всего 15 минут, включая тестовое кесарево сечение, разрезание тканей,, машинную обработку и фильтрацию, что составляет примерно восьмую часть времени, обычно занимаемого другими протоколами. Краткость этого протокола в сочетании с минимальным вмешательством в работу объясняет хорошую сохранность короткоживущих макромолекул, что имеет решающее значение, когда требуется репрезентативная выборка соединений, присутствующих в исходной клеточной популяции. Поскольку метан требует минимальной обработки, его легко воспроизвести в этой таблице.

Относительные проценты различных популяций клеток яичек для семи независимых экспериментов, проведенных на взрослых крысах и проанализированных с помощью проточной цитометрии, представлены в качестве примера, демонстрирующего воспроизводимость метода. В отличие от большинства используемых в настоящее время частиц для получения суспензий клеток яичка, представленный здесь метод не предполагает ферментативного действия. Несмотря на то, что коллагеназы капают в РНК, которые обычно входят в состав ферментов, способствующих недостаточной сегрегации тканей, они могут влиять на сохранность интересующих макромолекул.

Отсутствие ферментативных методов лечения не только способствует сохранению РНК и белка, но и делает протокол более дешевым. Хотя ранее сообщалось, что механически приготовленные клеточные суспензии слипаются легче, чем трипсы, мы обнаружили, что этот протокол приводит к хорошо десегрегированным клеточным суспензиям при отсутствии ферментативного действия. Включение NDA оказалось очень полезным в предотвращении слипания клеток.

Хорошее качество суспензий также подтверждается проведением цитометрического анализа образцов, о чем свидетельствует минимальное количество наблюдаемого клеточного мусора. Согласно опубликованной информации, около 13% круглых сперматозоидов обнаруживаются как многоядерные либо при получении клеточных суспензий исключительно механическим способом, либо в присутствии трипсина. Тем не менее, многие суспензии, приготовленные машинным способом, делают очень редкими многоядерные суспензии, скорее всего, из-за уменьшения распутывания, поскольку было указано, что многоядерные образования образуются в основном в результате манипуляций с тканями.

На этом рисунке показан пример многократно машинно приготовленной клеточной суспензии из яичек крысы. Как видно. Цитоплазмы хорошо сохранились, относительные процентные соотношения популяций С, 2 С и 4 С-клеток во многих машинно приготовленных тестикулярных суспензиях для различных грызунов вновь собрали те из интактных ТЭЛА.

Это подтверждает предположение о том, что описанный здесь метод не повреждает избирательно какой-либо конкретный тип клеток. Удивительно, но представление типа клеток во многих машинно приготовленных суспензиях сохраняется гораздо лучше, чем при классических методах приготовления капель. Как видно, цитографические изображения, полученные для суспензий яичковых клеток, обработанных meine, существенно не отличаются от ранее описанных.

Фактически, полученные гистограммы и точечные графики демонстрируют три характерные четыре популяции клеток С-С и С-яичек на основе содержания ДНК, а также популяцию субха, которая представляет собой высококонденсированные гаплоидные сперматозоиды. Эти профили наблюдались либо для ее устойчивых суспензий, либо для суспензий йодида пропидида соответственно, и это также относится к взрослым и молодым особям. Сортировка спермовых митогенных клеток была успешно достигнута с чистотой более 98%, либо для выбранных популяций яичек на основе содержания ДНК, либо даже для субпопуляций с одинаковым содержанием ДНК, но разным уровнем конденсации хроматина, таких как сонные и мозговые миоциты.

Как мы могли наблюдать на примере тестовых суспензий морских свинок, поскольку протокол не включает обработку РНК, отсортированные популяции обеспечивают хорошее качество РНК и позволяют проводить дифференциальные исследования экспрессии генов даже для популяций, окрашенных йодидом пропидиума. В этом смысле стоит напомнить, что в отличие от других красителей, красителей йодида пропидиума, ДНК, а также двухцепочечной РНК, однако, на этом графике анализа тестикулярной суспензии морской свинки, аналогичные профили получены с использованием йодида пропидиума параллельно с ярким оранжевым цветом. Это жизненно важный ДНК-специфичный краситель, показывающий, что окрашивание РНК не оказывает существенного влияния на цитометрические структуры гистограммы.

В этом списке обобщены основные преимущества процентного протокола. Описанный здесь оптимизированный метод позволяет всего за 15 минут ускорить приготовление подходящих суспензий клеток яичек для цитометрического анализа различных стадий сперматозоидов грызунов, включая диссекцию яичек, разрезание тканей и обработку с помощью системы МЭ. Краткость, более высокое качество воспроизводимости и пропорции типов клеток в клеточных суспензиях делают их хорошей альтернативой другим, более трудоемким и трудоемким методам самоподготовки, используемым в настоящее время.

Более того, поскольку этот метод включает в себя очень мало манипуляций и не требует ферментов и детергентов, он является идеальным выбором для деликатных последующих применений, таких как исследования экспрессии генов.