Простой и эффективный способ для подготовки яичек клеточные суспензии

В данном видео будет представлен очень простой и эффективный протокол получения клеточной суспензии из исследуемого материала грызунов всего за 15 минут. Метод применялся для анализа тканей мышей, крыс и морских свинок и использует устройство Meta Machine для дезагрегации инкапсулированной ткани. После фильтрации и окрашивания клеточная суспензия готова для проточной цитометрии.

Цитоанализ или сортировка. Однородность клеточных популяций является необходимым условием для анализа биохимических и молекулярных процессов в ходе дифференцировки мужских половых клеток. Таким образом, гетерогенность семенников, включающая более 30 различных типов клеток, представляет собой одну из основных проблем при изучении молекулярных основ сперматогенеза млекопитающих. По этой причине для получения обогащенных или очищенных популяций клеток семенников использовались различные методы, включая PU и центрифугирование.

Первым этапом любого метода разделения клеток является подготовка клеточной суспензии. Однако современные протоколы обычно требуют много времени и могут привести к потере короткоживущих молекул, таких как РНК, что нежелательно для последующего анализа экспрессии. Основным преимуществом представленного здесь протокола является исключение промежуточных этапов между жертвованием животного и специфическими молекулярными исследованиями стадии сперматогенеза, что при этом обеспечивает высокое качество и отличное представительство типов клеток в клеточных суспензиях.

Процедуру продемонстрируют доктор Ана Родригес, исследователь из AL Laboratory, разработавшая данный метод, и Федерико Сан Лопес, специалист по проточной цитометрии, отвечавший за цитометрический анализ. Для выполнения процедуры требуется компактное оборудование — система meach с аксессуарами medicon и fcon. При этом аксессуары fcon можно успешно заменить нейлоновыми мембранами с аналогичным размером пор.

Другими необходимыми материалами и реагентами являются стеклянный шпатель, две чашки, ножницы и пинцет, шприц объемом от 3 до 5 мл, камера для промывания кишечника, культуральная среда DMEM, дополненная 10% фетальной телячьей сыворотки и NDA. Если планируются последующие манипуляции с РНК, все материалы и растворы должны быть подготовлены соответствующим образом для выполнения протокола. Поместите препарированный семенник в стеклянную чашку диаметром 96 мм на льду, содержащую 10 мл охлажденной дополненной среды DMEM.

Удалите TAL Virginia, разрежьте декапсулированный семенник на квадратные кусочки размером два-три миллиметра с каждой стороны. Поместите четыре-пять таких кусочков в одноразовую десегрегационную пробирку medicon вместе с одним миллилитром среды, дополненной кодом D, и обработайте в системе meta machine в течение 50 секунд. Каждый блок medicon содержит фиксированное сито из нержавеющей стали с примерно сотней шестиугольных отверстий, окруженных шестью микролезвиями.

Ткань подается к каждому отверстию с помощью металлического ротора внутри камеры medicon и десегрегируется при прохождении через заостренные отверстия и металлический сетчатый экран, в то время как микронасос под экраном подает жидкость и вымывает оболочки. Соберите полученную клеточную суспензию из medicon с помощью шприца объемом от 3 до 5 мл без иглы. Затем смочите нейлоновый фильтр Falcon с размером ячеек 50 мкм или аналогичный сетчатый фильтр объемом 0,5 мл среды и профильтруйте через него суспензию.

Повторите этот шаг, используя нейлоновое сито с размером пор 25 мкм или эквивалентный модуль Falcon, и поместите образец на лед; возьмите аликвоту клеточной суспензии для подсчета в камере Нойе и доведите концентрацию клеток до 1–2 × 10⁷ клеток/мл в культуральной среде. В завершение добавьте NDA до конечной концентрации 0,2%, чтобы предотвратить слипание клеток, а также избежать засорения трубок при последующих исследованиях методом проточной цитометрии. Если планируется оценка жизнеспособности клеток, ее можно провести с помощью набора для определения жизнеспособности живых и мертвых клеток животных (Live/Dead Viability Kit) согласно инструкциям производителя, добавив флуоресцентный краситель перед проведением проточного цитометрического анализа.

Выбор флуорохрома зависит от имеющихся лазеров. В данной демонстрации будет показано использование различных красителей, связывающихся с ДНК. Хотя пропидиййодид обычно применяется в низких концентрациях для фиксированных или мертвых клеток, мы обнаружили, что при использовании в высоких концентрациях он проникает в нефиксированные клетки семенников в суспензиях, приготовленных по представленному здесь методу.

Это, вероятно, связано с возникающим механическим стрессом, который в сочетании с сенсорной природой эпителия семенных канальцев может привести к разрыву межклеточных соединений при минимальном воздействии. Для окрашивания пропидиййодидом за 10 минут до анализа образцов добавьте в суспензию клеток раствор с конечной концентрацией 50 µg/mL и инкубируйте при 0 °C в темноте. Для анализа окрашенных пропидиййодидом клеток и дальнейшей сортировки мы используем проточный цитометр FACSAria Vantage, оснащенный когерентным аргоновым ионным лазером с длиной волны излучения 488 nm. Мощность лазера установлена на 100 mW, а флуоресценция, излучаемая пропидиййодидом, регистрируется детектором FL2 с использованием полосового фильтра 575/26 nm.

Для проведения измерений методом проточной цитометрии используйте сопло диаметром 70 µm и программное обеспечение squa для анализа следующих параметров: прямого светорассеяния, бокового светорассеяния, общей эмиссионной флуоресценции или площади импульса, а также длительности флуоресцентной эмиссии или ширины импульса. Результаты представлены в виде гистограмм, отражающих количество событий при каждом уровне флуоресценции, и в виде диаграмм рассеяния (dot plots), отображающих зависимость бокового светорассеяния от площади флуоресцентного импульса и площади флуоресцентного импульса от его ширины.

Дублеты исключаются из анализа с помощью графиков DO (площадь флуоресцентного импульса в зависимости от его ширины) при сортировке популяций моноцитов SM; при этом режим сортировки системы fax vantage устанавливается на normal R или normal C, а в качестве конверта используются три отсортированные капли. Отрегулируйте дифференциал пробы, чтобы анализировать клетки со скоростью от 500 до 1500 в секунду. Поддерживайте температуру пробирок с образцом и сбора на уровне от трех до четырех градусов celsius с помощью охлаждающего устройства.

В качестве альтернативы клетки в суспензии можно окрасить другими флуорохромами. Например, можно использовать витальный краситель HER 3 3 3 4 2 до конечной концентрации 5 µg/mL и инкубировать в течение не менее 10 минут при 37 °C в защищенном от света месте для Hirsch.

Окрашено 3, 3, 3, 4, 2 образца. Анализ клеток проводили с помощью проточного цитометра MO, оснащенного лазером с длиной волны возбуждения в УФ-диапазоне, работающим при мощности 25 milliwatts, и соплом диаметром 70 micrometer. Для анализа тех же параметров, что были указаны ранее, используйте программное обеспечение Summit 4.3 или аналогичное, при этом анализ суспензий клеток проводится с использованием оптики фазового контраста для контроля качества суспензий.

Основными преимуществами данного протокола являются, во-первых, подготовка суспензий клеток семенников с использованием автоматизированного оборудования и получение результата всего за 15 минут, включая взятие биопсии, измельчение ткани, гомогенизацию, обработку на аппарате и фильтрацию; этот временной интервал составляет примерно одну восьмую от времени, обычно затрачиваемого при использовании других протоколов. Краткость данного протокола в сочетании с минимальным ручным воздействием обеспечивает хорошее сохранение короткоживущих макромолекул, что критически важно, когда требуется репрезентативная выборка соединений, присутствующих в исходной популяции клеток. Поскольку метод предполагает минимальное ручное вмешательство, он легко воспроизводим в данной работе.

Относительное процентное содержание различных популяций клеток семенников для семи независимых экспериментов, проведенных на взрослых крысах и проанализированных методом проточной цитометрии, представлены в качестве примера для демонстрации воспроизводимости метода. В отличие от большинства используемых в настоящее время способов приготовления суспензий клеток семенников, представленный здесь метод не предполагает ферментативного воздействия. Хотя капание коллагеназы в РНК, которые обычно включают в себя ферменты, способствует недостаточному разделению ткани, они могут повлиять на сохранность интересующих макромолекул.

Отсутствие ферментативной обработки не только способствует сохранению РНК и белков, но и делает протокол более экономичным. Хотя ранее сообщалось, что механически приготовленные клеточные суспензии склонны к более быстрому слипанию, чем трипсинизированные, мы обнаружили, что данный протокол позволяет получать хорошо десегрегированные клеточные суспензии даже в отсутствие ферментативного воздействия. Включение NDA оказалось очень эффективным для предотвращения слипания клеток.

Высокое качество суспензий также подтверждается при проведении цитометрического анализа образцов, о чем свидетельствует минимальное количество наблюдаемого клеточного дебриса. Согласно опубликованным данным, около 13% округлых сперматозоидов оказываются многоядерными как при подготовке клеточных суспензий исключительно механическим методом, так и в присутствии трипсина. Однако во многих суспензиях, приготовленных с помощью оборудования, многоядерные клетки встречаются крайне редко, что, вероятнее всего, связано с уменьшением спутывания клеток, так как было установлено, что многоядерность возникает главным образом вследствие манипуляций с тканью.

На данном изображении представлен пример суспензии клеток семенников крысы, подготовленной с помощью системы Many Machine. Как видно, цитоплазма хорошо сохранилась; относительные доли популяций клеток 2C и 4C в суспензиях тканей семенников различных грызунов, подготовленных системой Many Machine, соответствовали показателям интактных семенников.

Это подтверждает предположение о том, что описанный здесь метод не вызывает селективного повреждения каких-либо конкретных типов клеток. Как ни странно, репрезентативность типов клеток во многих суспензиях, приготовленных с помощью автоматизированных систем, сохраняется гораздо лучше, чем при использовании классических методов приготовления путем капельного нанесения. Как видно, цитометрические характеристики, полученные для обработанных суспензий клеток семенников, существенно не отличаются от ранее опубликованных данных.

Фактически, полученные гистограммы и диаграммы рассеяния демонстрируют три характерные популяции клеток семенников с содержанием ДНК от 4C до C, а также выраженную субгаплоидную популяцию, представляющую собой высококонденсированные гаплоидные сперматозоиды. Данные профили наблюдались соответственно для суспензий, окрашенных Hoechst или пропидиййодидом, как для взрослых, так и для молодых особей. Сортировка спермитогенных клеток была успешно проведена с чистотой более 98%, как для отдельных популяций семенников на основе содержания ДНК, так и для субпопуляций с одинаковым содержанием ДНК, но разной степенью конденсации хроматина, таких как сперматиды и сперматозоиды.

Как мы могли наблюдать на тестовых суспензиях тканей морской свинки, поскольку протокол не включает обработку РНК, отсортированные популяции обладают хорошим качеством РНК и позволяют проводить исследования дифференциальной экспрессии генов даже для популяций, окрашенных пропидийиодидом. В связи с этим стоит напомнить, что, в отличие от других красителей, пропидийиодид окрашивает как ДНК, так и двухцепочечную РНК; однако на данных графиках анализа суспензии семенников морской свинки профили, полученные с использованием пропидийиодида параллельно с красителем Vibrant Dye Cycle Orange (специфическим красителем для ДНК), оказались схожими. Это показывает, что окрашивание РНК не оказывает существенного влияния на характер цитометрических гистограмм.

В этом списке обобщены основные преимущества представленного протокола. Оптимизированный метод, описанный здесь, позволяет ускорить подготовку подходящих суспензий клеток семенников для цитометрического анализа различных стадий развития сперматозоидов грызунов всего за 15 минут, включая выделение семенников, измельчение ткани и обработку в системе ME machine. Краткость, более высокое качество воспроизводимости и пропорции типов клеток в суспензиях делают этот метод отличной альтернативой другим, более трудоемким и длительным методам самостоятельной подготовки, используемым в настоящее время.

Более того, поскольку этот метод предполагает минимальное количество манипуляций и исключает использование ферментов и моющих средств, он является идеальным выбором для таких деликатных последующих приложений, как исследования экспрессии генов.