Джин Захват Использование Gal4 в данио рерио
29 сентября 2013 г.
Этот протокол описывает метод генной ловушки инсерционного мутагенеза с использованием Gal4-VP16 в качестве основного репортера и GFP / RFP качестве вторичного журналистами в рыбок данио. Примерно один из десяти высокого выражения F0 гена выход рыбы ловушки потомство коэкспрессирующей GFP и RFP. Процедура скрининга могут быть легко масштабируется для адаптации к размеру лабораторией, проводящей инсерционного мутагенеза экран.
Общая цель этой процедуры заключается в получении мутантных рыб с использованием транспонирования разрушающих гены векторов с GAL 4, VP 16 в качестве основного репортера генных ловушек. Это достигается путем первой совместной инъекции вектора генной ловушки вместе с двумя высокими транспотами в эмбрионы рыбок данио. Введенные эмбрионы проверяются на флуоресценцию GFP через три дня после оплодотворения, и примерно 30% самых ярких эмбрионов отбираются для создания пула F zero.
Затем F-нулевую рыбу скрещивают с линией тестера U-A-S-M-R-F-P для скрининга зародышевой передачи событий генной ловушки. Последним шагом является скрещивание F1 для создания второго поколения F и получения эмбрионов для молекулярной характеристики событий генных ловушек с помощью обратной ПЦР и пяти простых рас. В конечном счете, примерно одна из 10 отобранных рыб с нулевым уровнем F должна произвести потомство генной ловушки.
Транспосы, разрушающие гены, были разработаны таким образом, чтобы не вызывать мутаций при интеграции в входы генов, кодирующих белки. Наши векторы GBT используют G 4 P 16 в качестве основного репортера о ловушках генов. Эта модификация повышает чувствительность к генам, экспрессируемым на низких уровнях, и позволяет нам использовать мутанты генных ловушек без чрезмерного избегания фенотипов в качестве драйверов G 4 для тканеспецифической экспрессии других трансгенов.
Мы считаем, что основным узким местом нашего метода является достижение достаточно высоких темпов интеграции генов trapp в зародышевой линии рыб с нулевым F. В этой демонстрации мы рассмотрим несколько важнейших этапов: подготовку ДНК, микроинъекцию и скрининг F zero. Вектор GBTB one использует GAL 4 VP 16 в качестве основного репортера о ловушках генов.
Минимальные высокие двойные транспоны на концах используются для интеграции генных ловушек. События генной ловушки обнаруживаются непосредственно репортером EGFP под контролем 14 X GAL four UAS. Вся кассета с генной ловушкой окружена прямыми замками P-сайтов.
Это делает события генной ловушки обратимыми за счет экспрессии гребней кри для установления доказательства причинно-следственной связи между конкретной интеграцией генной ловушки и наблюдаемым фенотипом. Кроме того, кассета U-A-S-E-G-F-P окружена прямыми участками FRT. Инъекция мРНК flip combs приведет к иссечению кассеты U-A-S-E-G-F-P, оставляя мутацию генной ловушки немаркированной флуоресценцией EGFP и позволяя использовать ее в трансгенных линиях, которые маркируют конкретные ткани или события развития с помощью флуоресценции GFP до микроинъекции.
Готовим транспонирование на ДНК и транспозирует мРНК. Подготовьте векторную ДНК GBTB с одним геном-ловушкой. Используя стандартный мини-набор для подготовки и следуя протоколу производителя, важно включить этап промывки PB в подготовку ДНК.
В противном случае мини-преп ДНК будет загрязнена РНК, А приведет к деградации транспозов Mr.NA разбавят ДНК в свободной воде РНК до 10 нанограммов на микролитр. Для получения высоких двух транспосов мРНК сначала линеаризуют ПТ три TS T два с использованием xbo один. Затем расшифруйте линеаризованную ДНК с помощью набора для транскрипции M Me Machine T three in vitro с одной модификацией.
Добавьте 0,5 микролитра ингибитора РНК блокировки ребер после этапа обработки ДНК, очистите мРНК с помощью стандартного набора и оцените качество транскрибируемой мРНК in vitro с помощью гель-электрофореза agros. Разбавьте мРНК в свободной воде РНК до 40 нанограммов на микролитр и храните в виде двух микролитров аликвот при температуре минус 80 градусов Цельсия непосредственно перед микроинъекцией. Приготовьте смесь для инъекций, добавив восемь микролитров разведенного транспоза на ДНК к двухмикролитровой аликвоте транспозированной мРНК.
Введите три нанолитра смеси D-N-A-R-N-A в желток эмбрионов одноклеточной рыбы зебры, используя стандартные методы микроинъекций, направленные на интерфейс желтка и богохульника. После инъекции внесите пять микролитров оставшегося раствора для инъекций в 1%-ный гель для контроля качества, чтобы убедиться, что транспозиция мРНК не разложилась примерно через шесть-восемь часов после инъекции. Удалите неоплодотворенные и мертвые эмбрионы и распределите эмбрионы до 60-80 на 100-миллиметровую чашку Петри. Аномальные и мертвые эмбрионы удаляют через один день после оплодотворения, через два дня после оплодотворения и через три дня после оплодотворения через три дня после оплодотворения с помощью стереомикроскопа, оснащенного флуоресценцией или вертикальным микроскопом.
Просмотрите эмбрионы и удалите любые аномальные эмбрионы. Просмотрите оставшиеся эмбрионы без явных дефектов. Для флуоресценции GFP выберите самые яркие эмбрионы с нулевым значением F и вырастите их, используя стандартные процедуры выращивания данио-рерио в этой лаборатории.
GBT обычно вводят в линии с диким типом или леопардовым рисунком пигментации. Разумно ожидать, что от 20 до 30% введенных эмбрионов, отобранных для выращивания, доживут до взрослого возраста. Интеграция одного вектора ловушки гена GBTB может привести к экспрессии EGFP с помощью двух различных механизмов.
Первое — это настоящее событие генной ловушки. Вектор интегрирует в ген слияние транскриптов между пятью простыми числами этого эндогенного гена и GAL 4 VP 16 и транслируется в гибридный белок, содержащий конечный конец белка и покрытый вставленным мутировавшим геном и GAL 4, VP 16. Этот гибридный белок связывается с 14 XUAS и активирует транскрипцию EGFP.
Второе, менее желательное событие – ловушка-усилитель. Минимальный промоутер перед EGFP находится под контролем усилителя рядом с местом интеграции, что приводит к производству EGFP в отсутствие GAL 4, VP 16. Чтобы различить эти два класса событий, была создана трансгенная линия 14 X-U-A-S-M-R-F-P, отмеченная специфичной для линзы гамма-кристаллической GFP.
События генной ловушки верифицируют путем скрещивания введенных GBT рыб с гомозиготными рыбами U-A-S-M-R-F-P и скрининга на коэкспрессию GFP и RFP, что возможно только в том случае, если GAL 4, VP 16 изготовлен и активирует U-A-S-M-R-F-P у транса для начала процедуры скрининга F нулевой рыбы скрещивания особи F zero с гомозиготной рыбой U-A-S-M-R-F-P. Поскольку рыбы, введенные в GBT, имеют дикий тип или леопардовую пигментацию, а гомозиготная линия U-A-S-M-R-F-P находится на латунном фоне, рыбу F zero можно легко отличить от рыбы U-A-S-M-R-F-P, что устраняет необходимость регистрировать, был ли проверяемый F zero самцом или самкой, а также потенциальные ошибки, возникающие в результате ошибок при регистрации и/или определении пола каждой рыбы. На следующий день.
Верните латунных рыбок U-A-S-M-R-F-P в их аквариум. Поместите рыб с нулевым значением F, которые дали эмбрионы, в отдельные статические резервуары, пока эмбрионы будут собраны для очистки, и перенесите собранные эмбрионы в новые чашки Петри во второй половине нулевого дня. Скрининг эмбрионов на флуоресценцию GFP и RFP через один день после оплодотворения и через три дня после оплодотворения.
Вытащите эмбрионы с положительным результатом как на GFP, так и на RFP, отсортируйте их по шаблону экспрессии G-F-P-R-F-P. Если в сцеплении наблюдается более одной закономерности и поднимите их, чтобы установить поколение F1. Обратите внимание, что эмбрионы 3D PF, которые положительны на GFP, но не на RFP, не извлекаются, поскольку они представляют собой события ловушки-энхансера.
Снова скрестите рыбу с нулевым значением F, которая произвела G-F-P-R-F-P положительное потомство, чтобы получить вторую партию положительного потомства. Рыбы F1 проверяются для установления двух семейств F, документирования паттерна экспрессии генов trapp и замораживания партий эмбрионов для молекулярной идентификации локусов генных ловушек. Поместите рыбу F1, которая дала эмбрионы, в отдельные статические резервуары, пока эмбрионы собираются для скрининга через один день после оплодотворения.
Мечение RFP, возможно, еще не было получено, поэтому проведите скрининг эмбрионов на флуоресценцию GFP и вытащите GFP-положительные эмбрионы через три дня после оплодотворения, скрининг как на GFP, так и на RFP флуоресценцию, а также вытащите двойные положительные результаты. Затем сфотографируйте эмбрионы с положительным результатом как на GFP, так и на RFP через пять дней после оплодотворения, заморозьте партии 20 G-F-P-R-F-P положительных и 20 G-F-P-P-R-F-P отрицательных эмбрионов для идентификации вставленных мутировавших генов с помощью обратной ПЦР и пяти простых рас. Вырастите оставшиеся G-F-P-R-F-P положительные эмбрионы, чтобы создать F в двух поколениях при успешной инъекции.
По крайней мере, 80% эмбрионов, введенных с помощью ДНК генной ловушки высотой в два транспоза, будут демонстрировать некоторую степень флуоресценции GFP. Низкая экспрессия GFP указывает либо на неудачную инъекцию, либо на деградацию транспонированной РНК из-за контаминации РНК. Когда для создания пула F zero отбираются самые яркие GFP-положительные эмбрионы, примерно одна из 10 отобранных рыб с нулевым уровнем F дает потомство генной ловушки среди рыб с нулевым F, из которых извлекаются события генной ловушки.
Большинство из них передают одно событие генной ловушки в дополнение к нескольким неэкспрессирующимся транспонированию интеграций. Поскольку вся кассета с генной ловушкой окружена прямыми замками P-сайтов, любые мутации генной ловушки, проиллюстрированные на этой диаграмме синими прямоугольниками, представляющими экзоны мутировавшего гена, обратимы за счет экспрессии гребней CRE. Эти изображения показывают совместную экспрессию GFP и RFP в нервной системе NSF TP six gene trap line введение РНК кри в эмбрионы N SF TP six приводит к потере экспрессии GFP и RFP.
Обратите внимание, что ожидаемого снижения экспрессии GFP в объективе не происходит. Большинство процедур, описанных здесь, применимы к другим скринингам генных ловушек, а также к регулярным экспериментам по трансгенезу с TOL 2 и другими транспозонами. Проведение от 20 до 30 скрещиваний F с нулевым аутом в неделю должно привести к восстановлению одной генной ловушки в неделю.
Тем не менее, процедуру можно легко масштабировать.
Обзор
Этот протокол описывает метод генетической ловушки для вставочной мутагенезиса у данио рерио с использованием Gal4-VP16 в качестве основного репортера и GFP/RFP как вторичных репортеров. Процедура позволяет идентифицировать потомство с генетической ловушкой, соизмеримо экспрессирующие GFP и RFP, с процессом скрининга, который можно масштабировать в зависимости от размера лаборатории.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Девелопментальная биология
- Трансгенные модели
Фон
- Генетическая ловушка для вставочного мутагенезиса - это техника, используемая для создания мутаций в определенных генах.
- Gal4-VP16 служит чувствительным репортером для экспрессии генов.
- GFP и RFP используются для визуализации событий генетической ловушки.
- Метод нацелен на минимизацию нежелательных мутаций при интеграции.
Цель исследования
- Создать мутантных данио рерио для функционального анализа генов.
- Улучшить чувствительность обнаружения экспрессии генов.
- Установить надежный метод скрининга для событий генетической ловушки.
Использованные методы
- Совместная инъекция векторов генетической ловушки и мРНК транспоразы в эмбрионы данио рерио.
- Скрининг на флуоресценцию GFP через три дня после оплодотворения.
- Скрещивание рыб F0 с тестер-линиями U-A-S-M-R-F-P для проверки передачи через геролинию.
- Выведение F1 для установления F2 поколения для молекулярной характеристики.
Основные результаты
- Примерно 30% самых ярких эмбрионов были отобраны для дальнейшего анализа.
- Примерно одна из десяти рыб F0 произвела потомство с генетической ловушкой.
- События генетической ловушки были подтверждены путем соизмерной экспрессии GFP и RFP.
- Механизмы интеграции были определены, включая истинные события генетической ловушки и события энхансер-ловушки.
Выводы
- Метод эффективно генерирует мутантов данио рерио для исследования функции генов.
- Высокие показатели интеграции генетической ловушки важны для успешных результатов.
- Этот подход позволяет реверсивное маркирование событий генетической ловушки для дальнейших исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
