Джин Захват Использование Gal4 в данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в получении рыб-мутантов с помощью транспозона, вызывающего разрыв гена, на векторах с GAL4 и VP16 в качестве основного репортера генной ловушки. Это достигается путем коинъекции вектора генной ловушки совместно с транспозазой Tol2 в эмбрионы данио-рерио. Инъектированные эмбрионы скринируют на наличие флуоресценции GFP на третий день после оплодотворения, после чего примерно 30% наиболее ярко флуоресцирующих эмбрионов отбирают для создания пула F0.

Затем рыб поколения F0 скрещивают с тестерной линией U-A-S-M-R-F-P для проверки передачи событий генного траппинга в зародышевой линии. Заключительным этапом является возвратное скрещивание F1 для создания поколения F2 и получения эмбрионов для молекулярной характеристики событий генного траппинга с помощью инверсионной ПЦР и 5'-RACE. В конечном итоге примерно одна из 10 проверенных рыб F0 должна дать потомство с генным траппингом.

Транспозоны для разрыва генов были сконструированы таким образом, чтобы не вызывать мутаций при интеграции в начальные участки кодирующих белков генов. В наших векторах GBT в качестве основного репортера генной ловушки используется G4P16. Эта модификация повышает чувствительность к генам с низким уровнем экспрессии и позволяет использовать мутантов генной ловушки без овердоидных фенотипов в качестве G4-драйверов для тканеспецифической экспрессии других трансгенов.

По нашему мнению, основным ограничивающим фактором нашего метода является достижение достаточно высокого уровня интеграции генных ловушек в зародышевую линию рыб поколения F0. В данной демонстрации мы разберем несколько критических этапов: подготовку ДНК, микроинъекцию и скрининг поколения F0. В векторе генной ловушки GBTB1 в качестве основного репортера генной ловушки используется GAL4-VP16.

Для интеграции генной ловушки используются минимальные транспозоны tall two с инвертированными повторами на концах. События генного траппинга напрямую детектируются с помощью репортера EGFP под контролем 14 X GAL four UAS. Вся кассета генной ловушки фланкирована прямыми сайтами P.

Это делает события генной ловушки обратимыми при экспрессии Cre-рекомбиназ для установления причинно-следственной связи между конкретной интеграцией генной ловушки и наблюдаемым фенотипом. Кроме того, кассета U-A-S-E-G-F-P фланкирована прямыми сайтами FRT. Инъекция мРНК Flippase-рекомбиназ приведет к эксцизии кассеты U-A-S-E-G-F-P, в результате чего мутация генной ловушки перестанет маркироваться флуоресценцией EGFP; это позволяет использовать данный метод в трансгенных линиях, в которых специфические ткани или события развития маркируются флуоресценцией GFP до проведения микроинъекции.

Подготовьте транспозазу ДНК и мРНК транспозазы. Подготовьте ДНК векторного конструкта GBTB для ловушки одного гена. При подготовке ДНК с использованием стандартного набора для мини-препа и в соответствии с протоколом производителя обязательно выполните этап промывки буфером PB.

В противном случае ДНК после мини-препа будет загрязнена РНК, что приведет к деградации мРНК транспозаз. Разведите ДНК в воде, свободной от РНК, до концентрации 10 nanograms per microliter. Для получения двух мРНК транспозаз сначала линеаризуйте PT three TS T two с помощью xbo one. Затем проведите транскрипцию линеаризованной ДНК, используя набор для транскрипции in vitro M message machine T three с одной модификацией.

После этапа обработки ДНК добавьте 0,5 µL ингибитора РНКаз RibLock; очистите мРНК с помощью стандартного набора и оцените качество мРНК, синтезированной in vitro, методом агарозного гель-электрофореза. Разведите мРНК в воде, свободной от РНКаз, до концентрации 40 ng/µL и храните в виде аликвот по 2 µL при температуре -80 °C до момента микроинъекции. Приготовьте инъекционную смесь, добавив 8 µL разведенной ДНК транспозазы к аликвоте мРНК транспозазы объемом 2 µL.

Введите три нанолитра смеси ДНК/РНК в желток одной клетки эмбрионов данио-рерио, используя стандартные методы микроинъекций, целясь в область интерфейса желтка и бластодермы. После инъекции нанесите пять микролитров остатков инъекционного раствора на 1% агарозный гель для контроля качества, чтобы убедиться, что мРНК транспозазы не подверглась деградации. Примерно через шесть-восемь часов после инъекции удалите неоплодотворенные и погибшие эмбрионы и распределите выжившие эмбрионы по 60–80 штук на чашку Петри диаметром 100 мм. Аномальные и погибшие эмбрионы удаляют через один, два и три дня после оплодотворения; на третий день после оплодотворения анализ проводят с помощью стереомикроскопа с флуоресцентным освещением или вертикального микроскопа.

Проведите скрининг эмбрионов и удалите все аномальные особи. Оставьте для дальнейшего анализа эмбрионы без явных дефектов. Для анализа флуоресценции GFP выберите наиболее ярко светящиеся эмбрионы поколения F zero и вырастите их, используя стандартные процедуры содержания zebrafish, принятые в данной лаборатории.

GBT обычно вводят в линии с диким типом или леопардовым паттерном пигментации. Ожидается, что от 20 до 30% инъецированных эмбрионов, отобранных для выращивания, доживут до взрослого состояния. Интеграция одного генного трап-вектора GBTB может привести к экспрессии EGFP двумя различными механизмами.

Первый случай представляет собой истинное событие генной ловушки. Вектор интегрируется в ген, в результате чего образуется химерный транскрипт между 5'-концом транскрипта этого эндогенного гена и GAL4-VP16; затем он транслируется в химерный белок, содержащий N-концевой домен белка, кодируемый мутировавшим геном вставки, и GAL4-VP16. Этот химерный белок связывается с 14XUAS и активирует транскрипцию EGFP.

Вторым, менее желательным событием является ловушка энхансера. Минимальный промотор перед EGFP попадает под контроль энхансера, расположенного рядом с сайтом интеграции, что приводит к экспрессии EGFP в отсутствие GAL four, VP 16. Чтобы различать эти два класса событий, была создана трансгенная линия 14 X-U-A-S-M-R-F-P, маркированная специфичным для хрусталика gamma crystalline GFP.

События генного трапирования подтверждаются путем скрещивания рыб, в которых была проведена инъекция GBT, с гомозиготными рыбами U-A-S-M-R-F-P и последующего скрининга на коэкспрессию GFP и RFP, что возможно только в том случае, если синтезируется GAL four, VP 16, который активирует U-A-S-M-R-F-P в транс. Чтобы начать процедуру скрининга рыб поколения F zero, скрестите отдельных особей F zero с гомозиготными рыбами U-A-S-M-R-F-P. Поскольку рыбы с инъекцией GBT имеют пигментацию дикого типа или леопардовый окрас, а гомозиготная линия U-A-S-M-R-F-P имеет латунный фон, рыб F zero можно легко отличить от рыб U-A-S-M-R-F-P, что избавляет от необходимости фиксировать пол скринируемой особи F zero, а также исключает возможные ошибки, связанные с неверной записью или определением пола каждой рыбы. На следующий день.

Верните рыб brass U-A-S-M-R-F-P в их аквариум. Поместите рыб F zero, предоставивших эмбрионы, в индивидуальные статические аквариумы, пока происходит сбор эмбрионов для скрининга; очистите и перенесите собранные эмбрионы в новые чашки Петри во второй половине дня нулевого дня. Проведите скрининг эмбрионов на флуоресценцию GFP и RFP через один день и через три дня после оплодотворения.

Отоберите эмбрионы, положительные по GFP и RFP, и рассортируйте их по паттерну экспрессии GFP и RFP. Если в одной кладке наблюдается более одного паттерна, вырастите их для получения поколения F1. Обратите внимание, что 3D PF эмбрионы, положительные по GFP, но отрицательные по RFP, не отбираются, так как они представляют собой события ловушки энхансера.

Повторно скрестите рыб поколения F0, давших GFPRFP-положительное потомство, чтобы получить вторую группу положительных особей. Рыб F1 подвергают скринингу для создания семейств F2 с целью документирования паттерна экспрессии генной ловушки и заморозки партий эмбрионов для молекулярной идентификации локусов генной ловушки. Сначала на следующий день скрестите отдельных рыб F1 с гомозиготными рыбами UASMRFP. Поместите рыб F1, давших эмбрионы, в индивидуальные статические аквариумы, в то время как эмбрионы собирают для скрининга на первый день после оплодотворения.

Маркировка RFP могла еще не проявиться, поэтому на третий день после оплодотворения проведите скрининг эмбрионов на флуоресценцию GFP и отберите GFP-положительные эмбрионы; затем проведите скрининг на флуоресценцию как GFP, так и RFP и отберите двойные положительные образцы. Затем на пятый день после оплодотворения сфотографируйте эмбрионы, положительные по GFP и RFP, и заморозьте партии по 20 GFP-RFP-положительных и 20 GFP-RFP-отрицательных эмбрионов для идентификации мутировавших генов вставки с помощью обратной ПЦР и 5'-RACE. Оставшихся GFP-RFP-положительных эмбрионов вырастите для создания второго поколения (F2) при условии успешной инъекции.

По крайней мере 80% эмбрионов, в которые была введена смесь ДНК генной ловушки и мРНК транспозазы, будут проявлять определенную степень флуоресценции GFP. Низкий уровень экспрессии GFP указывает либо на неудачную инъекцию, либо на деградацию РНК транспозазы из-за контаминации РНКазами. При отборе наиболее ярко светящихся GFP-положительных эмбрионов для создания пула F0 примерно одна из 10 обследованных рыб F0 даст потомство с генной ловушкой среди рыб F0, у которых были восстановлены события генной ловушки.

Большинство особей имеют одно событие захвата гена в дополнение к нескольким неэкспрессирующим интеграциям транспозонов. Поскольку вся кассета захвата гена фланкирована прямыми loxP-сайтами, любые мутации захвата гена, показанные на этой диаграмме (где синие прямоугольники представляют экзоны мутировавшего гена), обратимы при экспрессии CRE-рекомбиназы. На этих изображениях показана коэкспрессия GFP и RFP в нервной системе линии захвата гена NSF TP six; инъекция мРНК Cre в эмбрионы NSF TP six приводит к потере экспрессии GFP и RFP.

Обратите внимание, что, как и ожидалось, снижение экспрессии GFP в хрусталике отсутствует. Большинство описанных здесь процедур применимы как к другим скринингам с использованием генных ловушек, так и к обычным экспериментам по трансгенезу с использованием TOL two и других транспозонов. При использовании изложенного здесь метода генных ловушек постановка 20–30 возвратных скрещиваний F0 в неделю должна привести к получению одной генной ловушки в неделю.

Тем не менее, данную процедуру можно легко масштабировать.