Сбор, выделение и обогащение природного происхождения магнитотактических бактерий из окружающей среды

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать магнетобактерии из пресной воды. Это достигается путем предварительного сбора образцов водных отложений с края реки или озера. Второй шаг заключается в выделении магнетотактических бактерий, содержащихся в образце окружающей среды, с помощью стержневого магнита.

Затем магнетобактерии обогащаются с помощью стеклянной капиллярной дорожки и магнита. Наконец, с помощью оптической микроскопии характеризуются магнитотактические бактерии. В конечном счете, просвечивающая электронная микроскопия используется для определения размера и формы бактерий и их магнетитсодержащих магнетозон.

Этот метод помогает нам понять ключевые вопросы микробиологии окружающей среды, например, как магнето эволюционировало на Земле и как магнетобактерии синтезировали магниты нанометрового размера. Демонстрировать процедуру сегодня будет Закари Страйкер. Закари является кандидатом наук в моей лаборатории.

Он работает со мной и моим братом здесь, в Университете штата Огайо. При выборе пресноводного участка для сбора магнетобактерий или MTB, часто лучше всего начать с пруда или медленно движущегося ручья, который имеет мягкий слой илистых отложений. В этой демонстрации мы собрали образец на берегу реки Оланд Танги в кампусе Университета штата Огайо в Колумбусе, штат Огайо.

Найдите место, где глубина воды составляет от 10 до 100 сантиметров, и с помощью прозрачного контейнера с завинчивающейся крышкой заполните контейнер самым верхним слоем осадка, а оставшееся пространство водой, закройте контейнер под водой обратно в лабораторию, ослабьте крышку и оставьте ее накрывающей контейнер, чтобы уменьшить испарение, и храните его в темноте от нескольких часов до нескольких дней, чтобы дать осадок и найти частицы для оседания. Сделать гоночные трассы для обогащения горного велосипеда. Начните с использования алмазной ручки или напильника, чтобы отрезать верхнюю часть стеклянной пипетки диаметром 5,75 дюйма, оставив достаточно места для одного-двух миллилитров воды.

Далее с помощью горелки и уплотните наконечник автоклава. Некоторые поднимают гусеницы вместе с ватой и длинными металлическими иглами. Когда будете готовы изолировать горный велосипед, разместите магниты по бокам пластикового контейнера, примерно на один сантиметр выше границы раздела осадочной воды с южным и северным полюсами на противоположных сторонах контейнера.

Следите за тем, чтобы не потревожить осадок. Подождите от 30 минут до нескольких часов, пока бактерии не доплывут до магнита. Затем с помощью шприца удалите жидкость из контейнера для образца рядом с границей раздела осадочной воды.

Прикрепите фильтр к шприцу и металлическую иглу к фильтру, следя за тем, чтобы в капилляре не было пузырьков. С помощью иглы добавьте отфильтрованную пробу воды в автоклавный гоночный трек с помощью стерильной ваты и металлической иглы. Заглушите гоночную дорожку, протолкнув вату внутри капилляра на расстояние от 0,5 до одного сантиметра от герметичного конца.

С помощью стерильной пипетки удалите бактерии magneto tactic из контейнера, где они сгруппированы возле южного полюса магнита, и добавьте MTB, содержащий воду, в открытый конец гоночной дорожки. Как только гоночная дорожка будет заполнена жидкостью для пробы, положите ее на бок на горизонтальную поверхность и поместите южный полюс стержневого магнита рядом с уплотнительным наконечником гоночной дорожки. Подождите от пяти до 30 минут, пока горный велосипед пройдет через хлопок.

С помощью алмазного ножа аккуратно сделайте небольшую царапину возле ватной пробки и отломите конец гоночной дорожки. С помощью одномиллилитрового шприца с узкой иглой удалите жидкость, обогащенную МТБ, с кончика гоночной дорожки. Чтобы наблюдать за горным велосипедом с помощью световой микроскопии, поместите каплю обогащенного образца на покровное стекло.

Наденьте защитный колпачок на уплотнительное кольцо, которое опирается на предметное стекло. Это называется висячей каплей. Уплотнительное кольцо должно иметь немного меньший диаметр, чем покладка крышки.

Затем поместите предметное стекло на предметный столик для светового микроскопа и сфокусируйтесь на одном краю капли. Затем, чтобы притянуть горный велосипед к одной стороне капли, поместите южный конец магнита рядом с этой стороной в течение нескольких минут, многие горные велосипеды должны быть на краю капли. Для наблюдения за MTB с помощью ПЭМ поместите на каплю обогащенных бактерий медную сетку размером 200 меш, стабилизированную var и покрытую углеродом, и дайте образцу отстояться в течение 10 минут.

Промыв образец на капле воды в течение 30 секунд, поместите его на каплю 2%-ного ацетата писсуара на срок от 30 секунд до пяти минут, а затем с помощью листа фильтровальной бумаги полностью проанализируйте образцы с помощью просвечивающей электронной микроскопии при напряжении 200 киловольт. Здесь показано изображение одной магнетотактической бактерии, полученное с помощью просвечивающего электронного микроскопа, обогащенное из образца осадка окружающей среды. Спираль и морфология клеточной и магнетозон хорошо видны вместе с одним флегелем.

После того, как магнитотактические бактерии будут собраны из окружающей среды, метод магнитной сепарации займет около трех часов, если он выполнен правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ 16 s рибосомальной РНК, который ответит на дополнительные вопросы, например, каково филогенетическое отношение недавно обнаруженных бактерий магнитотактической тактики к другим, к другим микроорганизмам.