Гистологическая характеристика интактного мозга имплантированных Microdevices и окружающих тканей

Целью этой процедуры является визуализация неповрежденного интерфейса мозговой ткани вокруг хронически имплантированных микроустройств в ткани мозга грызунов. Это достигается за счет использования силиконового эластомера Quick Cell и двухкомпонентного стоматологического акрила, чтобы покрыть трепанацию черепа и сформировать черепную крышку вокруг имплантированного устройства для мозга. После перфузии животного с помощью фиксирующей и посмертной обработки тканей имплантированная часть устройства отделяется от головной крышки путем сжигания зубного акрила и разрезания быстрой клетки.

Затем мозг удаляется и разрезается с помощью виома, чтобы зафиксировать имплантат в тканевом срезе. Заключительным этапом является подготовка ткани к флуоресцентной визуализации путем промывки маркировки, а затем очистки участка ткани в оптическом растворе для очистки. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для того, чтобы показать интактную биологическую реакцию, которую проникающий мозговой имплантат вызывает в окружающих тканях на субклеточном уровне.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как объяснение, устройство, заключается в том, что он позволяет избежать нарушения окружающей ткани и прилегания к имплантированному устройству, чтобы можно было исследовать сопряженную ткань в неповрежденном виде. Этот метод основан на передовых методах иммуногистохимии и микроскопии и позволяет получить данные конфокальной микроскопии, которые подробно описывают область, окружающую имплантированное устройство для мозга. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейропротезирования, такие как степень, в которой местная гибель клеток, образование глиальных рубцов и реорганизация кровеносных сосудов действительно влияют на срок службы имплантированных микроэлектродов в мозг.

Тем не менее, этот метод может дать представление о хроническом нейронном интерфейсе имплантированных в мозг микроэлектродных матриц. Методы, используемые в этом методе, также могут быть применены в других областях исследований в области нейробиологии, включая имплантированные канюли или волоконную оптику. С помощью солдатика сделайте окно в углублении из акрила и обнажите область под ним быстрого герметизации.

Устройство должно быть видно в прозрачной быстросъемной упаковке. Далее под хирургическим микроскопом врезаем в силиконовый эластомер парой изогнутых микроножниц. Затем удалите небольшие кусочки быстрого уплотнения с помощью пинцета и микроножниц вниз до того места, где устройство входит в мозг.

Продолжайте резать вдоль поверхности трепанации черепа, чтобы отделить компоненты устройства, прикрепленные к поликремнию и черепу, от компонентов, имплантированных в мозг. Будьте осторожны при резке через открытые компоненты устройства. Избегайте проталкивания или втягивания имплантатов в неподвижную ткань.

Затем осторожно удалите кость вокруг головной шапки, используя после этого сырые шеи. С помощью шпателя отделите мозг с имплантированным устройством от черепа. Теперь поместите мозг в стеклянную чашку Петри, наполненную HBHS.

Используйте мозговой блок и бритвенные лезвия, чтобы разрезать мозг и создать плоскую плоскость, точно соответствующую углу имплантированных устройств. После этого продавите два бритвенных лезвия через ткани мозга, обнажив плоскую поверхность, на которую будет установлен Вибрам. Затем подложите немного льда под платформу Vibram.

Затем кратко просушите поверхность ткани на бумажном полотенце. После этого сориентируйте образец таким образом, чтобы самый широкий размер был параллелен направлению движения вибрационного тонального лезвия, чтобы избежать потенциального опрокидывания ткани лезвием, немедленно приклейте плоскую плоскость к столику суперклеем. После того как клей закрепит охлажденный PBS на чашке для вибрато вокруг ткани.

Теперь разрежьте срезы ткани размером от 250 до 500 микрон, используя максимальную частоту вибрации и медленную скорость движения лезвия с углом лезвия 10 градусов от горизонтали. Затем аккуратно соберите ломтики с помощью кисти и лопатки и храните HBHS в 24-луночной пластине при температуре четыре градуса Цельсия, собирая ломтики, записывайте толщину и расположение каждого ломтика по мере их извлечения на 24-луночную пластину. Как только устройство Insitu станет видимым, соберите срез ткани толщиной около 500 микрон.

Для того, чтобы захватить устройство в один срез ткани и собрать более тонкий срез ткани, срезы размером 100 микрон могут быть аккуратно собраны вплотную к устройству. В этот момент можно собрать кусок толщиной менее 500 микрон с помощью устройства внутри. Начните обработку тканей с промывки срезов три раза по пять минут за промывку в HBHS.

Затем инкубируйте их в гидриде бора натрия в течение 15 минут. С каждой стороны среза медленно переверните срез с помощью маленькой кисточки для рисования и избегайте прикосновения к участкам вокруг имплантированного устройства. Микроложка из нержавеющей стали или тефлонового покрытия также может быть использована вместе с маленькой кистью.

Теперь промойте ломтики три раза по пять минут за промывку в промывном растворе комнатной температуры. Залейте их в моющем растворе на два часа при комнатной температуре, переворачивая ломтики. Через час через два часа инкубируйте срезы в первичном антителе в течение примерно 48 часов при четырех градусах Цельсия.

Далее выполните шесть быстрых трехминутных стирок с раствором для стирки. Затем выполните шесть промываний по одному часу в растворе для стирки. После этого инкубируйте их во вторичных антителах в течение примерно 48 часов при четырех градусах Цельсия.

Снова выполните шесть быстрых промываний по три минуты, а затем шесть промываний по одному часу в растворе для стирки. Затем удалите раствор для промывки и добавьте раствор для удаления накипи U2 на основе глицерина. Накройте тарелку фольгой и храните при температуре четыре градуса Цельсия.

Дайте толстым срезам очистить примерно одну неделю или очень толстым срезам ткани в течение двух-трех недель при температуре четыре градуса Цельсия. После зазора закрепите срезы ткани на предметных стеклах, используя раствор для очистки в качестве монтажной среды. Заклейте все предметные стекла прозрачным лаком для ногтей и храните их на расстоянии четырех градусов Цельсия от света, используя объективы микроскопа с большим рабочим расстоянием.

Начните визуализацию с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа или двухфотонного микроскопа. С помощью программного обеспечения для отправки XS L SM seven 10 Carl Xi и управляемого компьютером переносного столика XY в изображение мы продемонстрируем 3D-панораму вокруг имплантата для коррекции показателя преломления очищающего раствора. В этой демонстрации мы вводим значение показателя преломления 1,4 в программное обеспечение микроскопа Leica Zen для решения для очистки U2.

Эта настройка тонко регулирует интервалы Z-шага с учетом несоответствия показателя преломления в ткани рядом с устройством. Грубо оцените подходящее окно оси Z и настройки сбора данных в размерности zdi для каждого флуоресцентного канала с использованием низкой мощности лазера, примерно от 0,5 до 5%, и больших размеров шага Z. Затем с помощью программы Zen panorama установите объектив в центре XY конечной панорамы и определите количество позиций сбора, необходимых для осей x и y.

Чтобы охватить интересующую вас область, переоцените и завершите окно сбора данных по оси Z, быстро проверив первый и последний кадры стека. Затем вручную установите чувствительность детектора и мощность лазера для нарастания в соответствии с увеличенной глубиной. Как правило, цель состоит в том, чтобы поддерживать примерно одинаковую интенсивность изображения независимо от глубины визуализации в срезе ткани, а также избежать высокого уровня фонового шума.

Соберите каждый ряд данных флуоресцентного изображения, если это необходимо, чтобы избежать наложения сигналов, прогоните лазерные линии последовательно. Измените настройки программного обеспечения для сбора данных или данных о коэффициенте пропускания и используйте более длинный лазер с более проникающей длиной волны, например, 6 33 нанометра для захвата этих каналов. Затем определите подходящую мощность лазера и определите чувствительность к сбору отражательной способности и коэффициента пропускания и повторите ту же серию сбора вокруг имплантированного устройства.

Наконец, экспортируйте данные для последующей обработки, количественного определения и анализа. Визуализация с любой стороны предметного стекла может позволить вам оценить границу раздела вокруг устройства, как показано здесь, где микроглия вдоль кремниевой основы MEA видна с одной стороны, а микроглия вдоль участков электродов и следы видны с другой стороны. После того, как смонтированная ткань может быть визуализирована с помощью шага преобразования XY, могут быть созданы обзоры флуоресцентных меток по всему срезу ткани с желаемым разрешением.

Здесь ядра клеток окрашены крючками 3, 3, 3, 4, 2, а моноцитарная микроглия мечена 3, 2, 9. Анти IBA одновременно визуализировался на отдельных каналах. Также были собраны данные о просвечивающем свете и отражательной способности, показывающие расположение четырехнедельного имплантата по отношению к крючкам и данным IVA One, наложению всех каналов, но здесь показана передача.

Детальное исследование морфологически сохраненной тканевой границы вокруг имплантированных микроустройств может быть собрано при большом увеличении для анализа местного тканевого ответа, отражательная способность и пропускание позволяют локализовать устройство, в то время как флуоресцентные антитела или химические метки позволяют детально визуализировать компоненты ткани вдоль границы раздела интактной ткани. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что нужно уделить время тщательному разделению имплантированных устройств через головной колпачок и планировать, что этот шаг займет более 30 минут. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собирать и обрабатывать срезы мозга, содержащие имплантированные устройства.

Вы также должны уметь маркировать и собирать гистологические данные, описывающие нейробиологию, окружающую эти устройства.