Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

В соответствии с этим протоколом создаются ковалентно стабилизированные комплексы трансмембранных пептидов для структурных исследований, направленных на понимание того, как мембранные белки взаимодействуют друг с другом через свои липидные домены. Во-первых, экспрессируйте помеченный hist гибридный белок, содержащий трансмембранную последовательность, представляющую интерес у кишечной палочки. Затем извлеките белок из фракции тела включения с помощью гины и моющего средства с использованием матрицы сродства к никелю.

Концентрируйте меченый фьюжн белок и дисульфид сшивайте его до диаметральной формы, промывая колонку в растворе, содержащем окислители. Затем элюируют сшитый гибридный белок в уксусной кислоте Tri Fluor и обрабатывают бромистым цианогеном для высвобождения партнера по слиянию, а затем выделяют продукт сшитого пептида из смеси для расщепления с помощью ВЭЖХ в обращенной фазе. В конечном счете, идентичность и чистота продуктов проверяются с помощью SDS page и масс-спектрометрического анализа.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что для структурных исследований создаются чистые социометрические комплексы с использованием таких методов, как растворный или твердотельный ЯМР. Даже когда известно, что два трансмембранных домена взаимодействуют, растворимость пептидов и образование комплекса часто противоречат друг другу в экспериментальных условиях. Начав с хорошо определенного ковалентно стабилизированного комплекса, можно значительно расширить диапазон экспериментальных условий, которые могут быть проверены для высококачественного сбора данных.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут бороться с трудностями работы с этими чрезвычайно гидрофобными фрагментами белка. Этот протокол и советы, представленные в сопроводительной рукописи, предназначены для того, чтобы предложить простое решение некоторых из наиболее распространенных проблем в процессе прогнозирования и очистки. Нёбо, однолитровая культура бактерий, экспрессирующих синтез и ресуспендирование пептидов требухи в 50 миллилитрах буфера для лизиса.

Затем выполните три цикла ультразвуковой обработки на максимальной мощности в течение одной минуты и охладите на льду в течение пяти минут. Соберите нерастворимый материал тела включения центрифугированием при 20 000 G в течение 15 минут, сцедите и отложите надосадочную жидкость. Стадии ультразвука и центрифугирования могут быть повторены, если требуется улучшенная чистота фракции IB.

Резервные образцы гранул и надосадочной жидкости для анализа страницы SDS для подтверждения поездки. Локализация слияния ТМ с тельцами включения теперь растворяет гранулы тела включения в растворе гвины, используя от 25 до 50 миллилитров на литр культуры. Обработанную смесь аккуратно перемешивают при комнатной температуре в течение нескольких часов с периодическим загаром.

Затем очистите лизат тела включения центрифугированием при температуре от 75 000 до 100 000 раз G в течение одного часа. При комнатной температуре отфильтровать супернат через мембрану толщиной 0,2 микрона в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Смешайте очищенный лизат тела включения со смолой сродства никеля, которая была уравновешена до раствора гина для связующего пакета.

Аккуратно перемешайте суспензию в течение ночи при комнатной температуре. Загрузите суспензию лизатно-никелевой смолы тела включения в пустую колонну самотечного потока с опорой из пористого слоя до тех пор, пока не пройдет весь объем. Соберите и отложите в сторону поток, через который еще может содержаться несвязанный термоядерный белок.

Затем промойте никелевую смолу под действием силы тяжести. Расход с пятью объемами слоя раствора мочевины, содержащего пять миллимолярных пучков меркаптоэтанола. Для третьей промывки выполните вторую промывку без луча меркаптоэтанола.

Используйте раствор мочевины с добавлением медного купороса и окисленного глутатиона. Затем закройте выходное отверстие колонки и инкубируйте 30 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить максимальное образование дисульфидной связи. Окисляющий раствор мочевины смыть 10 объемами воды.

Затем примените вакуумную линию для сушки слоя колонны и закройте выходное отверстие колонны. Теперь в химическую защитную капюшонку добавьте 1,5 спальных объема чистых ТФК, размешайте никелевую смолу небольшим шпателем, чтобы обеспечить равномерное воздействие кислоты, и инкубируйте в течение пяти минут. Соберите кислоту под давлением осторожно с помощью сжатой воздуховоды, если это необходимо, чтобы вытолкнуть всю жидкость.

Повторите этап кислотного разбавления с еще 1,5 объемами слоя чистой ТФК Чтобы измерить выход белка, произведите разбавление ЭИТ ТЖК в трифторэтаноле и измерьте абсорбцию на 280 нанометрах по отношению к A-T-F-A-T-E. Разбавьте кислоту elu до 80% конечной концентрации TFA по каплям. Добавление воды при аккуратном перемешивании.

Если вы выпадали в осадок, добавьте небольшое количество ТЖК до тех пор, пока раствор не прояснит. Затем повторно скорректируйте до 80% водой. Зарезервируйте пятилитровый образец предварительного переваривания для анализа страницы SDS и немедленно заморозьте его в жидком азоте.

Далее взвесьте кристаллы бромида цианогена примерно по 0,2 грамма на миллилитр образца. Позаботьтесь о безопасном взвешивании токсичного химического вещества. Добавьте бромид цианогена в образец в защитном колпаке и аккуратно перемешайте до полного растворения.

Теперь промойте реакционный сосуд в герметичном растворе инертного газа и инкубируйте в течение трех-четырех часов при комнатной температуре, защищенной от света. Зарезервируйте пятилитровый образец пост-дайджеста для анализа страницы SDS, немедленно заморозьте его в жидком азоте и лиофилизируйте вместе с образцом предварительного переваривания. Затем переведите реакцию расщепления в регенерированную кассету для диализа целлюлозы, что позволит значительно увеличить объем.

Диализируйте образец в течение ночи в сравнении с четырьмя литрами воды в химическом женском капюшоне. На следующее утро извлеките из диализной кассеты диализованный реакционный раствор со взвешенным белковым осадком и переложите суспензию в 50-миллилитровую коническую трубку. Затем заморозьте и лиофилизируйте образец в течение нескольких дней, чтобы удалить воду и любые следы цианогена, бромида и ТЖК, растворите до 100 миллиграммов лиофилизированных продуктов распада в трех миллилитрах чистой муравьиной кислоты, перемешав до полного очищения раствора.

Загрузите образец на колонку препаративных весов Zoax SB 300 C3 в потоке растворителя А с помощью петли для отбора проб объемом пять миллилитров. Затем разбавьте продукты распада градиентом растворителя В, по крайней мере, в пяти объемах колонны. Анализ фракций ВЭЖХ по странице SDS и масс-спектрометрии MALDI TOF для идентификации интересующего вида и подтверждения его ожидаемой массовой лиофилизации.

Фракции ВЭЖХ, содержащие продукт сшитого пептида. Если продукт высыхает до пленки, а не порошка, его можно повторно растворить в небольшом объеме HFIP, замороженном в жидкости и лиофилизированном. Опять же, в результате получится пушистый белый конус, который легко опрокидывается и взвешивается Последовательность ДНК, кодирующая трансмембранные и маркирующие участки трансмембранной сигнальной молекулы иммунорецептора.

DAP 12 клонировали в пептидный вектор PMM с использованием сайтов рестрикции Hindi three и BAM H one. Полученная в результате бактериальная экспрессионная конструкция образует меченый трип-фьюжн белок с уникальными внутренними остатками метионина и цистина для расщепления бромида цианогена и окислительного сшивания. Уровень экспрессии, достигаемый при слиянии требух, варьируется в зависимости от аминокислотной последовательности присоединяемого пептида.

Этот препарат дал примерно 120 миллиграммов чистого интактного термоядерного белка из одного литра культуры и четырех миллилитров никелевой матрицы. После лизиса клетки гибридный белок локализовался в грануле тела включения. Примерно 70% очищенного никелем трахея DAP 12 TM было сшито дисульфидом до формы DME.

Несмотря на то, что продукты пептида DAP 12 TM не могут быть легко идентифицированы в образцах общего расщепления бромистого цианогена, сравнение неповрежденных полос расплавления и полос расщепления в образце восстановленного расщепления показывает, что разложение расплавленного вещества было завершено примерно на 60% при этом типичном разделении продуктов распада. В колонке С3 препаративного масштаба с использованием ВЭЖХ с обратной фазой связанные продукты были представлены в виде двухступенчатого градиента растворителя В. Продукт сшитого пептида дисссульфида можно идентифицировать при анализе основных фракций ВЭЖХ в условиях без восстановления и восстановления. Масс-спектрометрический анализ Maldi tof подтверждает идентичность дем-пептида на пике 4 с основным продуктом при 6729,2 дальтонах.

Не забывайте, что работа с цианогеном, бромидом, органическими растворителями и концентрированными кислотами может быть крайне опасной. При выполнении этих процедур следует надевать соответствующее защитное снаряжение, а с бромом цианогена никогда не следует обращаться вне утвержденного капюшона химической защиты. Этот метод обеспечил ключевой материал для исследования трех различных растворных и мр структур трансмембранных пептидных комплексов, демонстрирующих, как мультисубъединичные иммунные рецепторы собираются посредством белковых взаимодействий в мембране лимфоцитов.

Мы считаем, что применение этого метода окажется столь же ценным и для других мембранных белковых систем.