Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы пометить отдельные нейроны в центральной нервной системе эмбрионов дрозофилы на ранней стадии 17. Это достигается путем сбора яиц и предоставления им возможности развиться до нужной стадии. Вторым этапом процедуры является ручное хлорирование и выравнивание яиц.

Вслед за этой дивой, колонизация и подпиливание эмбрионов делает нервный канатик доступным. Заключительным этапом является маркировка одиночных клеток с помощью ионоретикального применения липофильной матрицы глаза. В конечном счете, результаты позволяют визуализировать морфологию одного нейрона, если это необходимо, в контексте известных паттернов экспрессии GFP и/или на фоне мутантов.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами мечения одиночных клеток, такими как маркум, заключается в том, что она работает в эмбрионе и позволяет визуализировать идентифицированные клетки намеренно. Визуальная демонстрация этого метода чрезвычайно полезна, так как многие шаги являются тонкими и поэтому сложными для изучения. Позвольте здоровым мухам отложить эмбрионы на агаровые пластины.

Заменяйте пластину каждые полтора часа при температуре 25 градусов Цельсия и сохраняйте эмбрионы. Инкубируйте эмбрионы на их тарелках при температуре 25 или 18 градусов Цельсия, пока они не достигнут необходимой стадии развития. Когда все будет готово, переложите зародыши на предметное стекло, накрытое двусторонним скотчем.

Избегайте переноса любого агара вместе с эмбрионами, так как это будет мешать их приклеиванию к ленте. На ленте. Дайте эмбрионам высохнуть в течение 5-10 минут, пока ждите.

Покройте покровный слип размером 24 на 60 миллиметров гептановым клеем. Поместите небольшую каплю клея в центр предметного стекла и распределите ее в очень тонкую пленку с помощью 18-миллиметрового квадратного покровного стекла. Как только эмбрионы высохнут, аккуратно прикоснитесь к ним иглой.

Корион расколется, и эмбрион прилипнет к игле. Немедленно перенесите дехлорированные эмбрионы в агаровый блок, чтобы предотвратить их высыхание. Выровняйте их там 10 в ряд, подфюзеляжными сторонами вверх.

Срежьте излишки агара с блока с помощью скальпеля. Затем осторожно прикоснитесь к эмбрионам с помощью гептанового клея, покрытого покровным листом. Они должны прилипать к чехлому подфюзеляжной стороной вниз.

Наклейте рамку из клейкой ленты вокруг крышки и прикрепите ее к предметному стеклу микроскопа. Хранение эмбрионов сверху накрывается крышкой. Накройте эмбрионы обильным количеством PBS на дорсальной стороне каждого эмбриона рядом с его задним концом.

Проникните в вительную оболочку стеклянной иглой, разорвите мембрану по дорсальной средней линии и вытащите эмбрион из оболочки. Теперь переориентируйте вентральную сторону эмбриона вниз в другое место на субстрате из гептанового клея. Подпилите эмбрион стеклянной иглой, аккуратно продырявляя стенку тела и разрывая по дорсальной средней линии.

С помощью иглы надавите на стенку тела, чтобы она прилипла к предметному стеклу. Разорвите кишку на ее переднем и заднем концах и поднимите кишку. Поскольку несколько эмбрионов будут подшиты на одном и том же предметном стекле, полезно либо очень точно определить их ориентацию, либо сделать рисунок их ориентации.

Затем эмбрионы могут быть слегка зафиксированы в течение 10-15 минут в 7,4%-ном формальдегиде в PBS, а затем четыре промывки в PBS, используя крайнюю осторожность, чтобы избежать прикосновения эмбрионов к поверхности раствора. Силы поверхностного натяжения разрушат их под 10-кратным объективом. Центрируйте поле зрения на подготовленном эмбрионе, увеличьте увеличение и определите местоположение интересующей клетки под оптикой DIC или под флуоресценцией.

Если клетка-мишень выражает GFP, убедитесь, что полевая диафрагма микроскопа открыта только до края поля зрения, а не за пределами узкого освещения. Луч поможет расположить микропипетку, сменить объектив обратно к 10-кратному объективу и поместить электрод ванны для усилителя постоянного тока в раствор вдали от эмбриона и пути микропипетки. Установите инъекционный микропипет, наполненный раствором хлорида лития, в держатель и прикрепите его к микроманипулятору.

С помощью курсовых регуляторов микропипетка расположится ниже объектива и значительно выше эмбриона. Если угол наклона микропеппе слишком крутой, кончик не попадет в фокус. Если он слишком мелкий, шахта будет загрязнять стенку ванны по центру кончика в поле зрения.

Теперь опустите микропипетку и фокусируйтесь поочередно, пока пипетка не окажется в PBS и не слишком высоко над эмбрионом. Теперь переключитесь на объектив высокой мощности и центрируйте пипетку в поле зрения. Когда вал находится в фокусе, перемещайте микропипетку по оси X до тех пор, пока ее кончик не окажется в центре поля зрения.

Наконечник микропипетки должен находиться значительно выше уровня эмбриона. Переключитесь на флуоресцентное освещение и осмотрите наконечник. Проверьте, не протекает ли глаз с красителем.

Отрегулируйте постоянный ток так, чтобы на кончике не скапливался кристалл глаза с красителем. Теперь опустите микропипетку по оси Z по направлению к эмбриону. Постепенно корректируя фокус по мере того, как эмбрион попадает в фокус

Переключитесь на использование тонкого управления. Сфокусируйте вводимую клетку в центре поля, а затем снова сфокусируйтесь на наконечнике микропипетки. С этого момента может быть более удобно использовать столик микроскопа для перемещения эмбриона относительно микропипетки.

Приблизьте наконечник микропипетки к клетке и сделайте углубление на его поверхности. Пропустите несколько наноампер деполяризующего тока в течение нескольких секунд. На клетке образуется небольшой кристалл глазного красителя, чтобы подтвердить, что клетка была помечена.

Кратковременно откройте затвор, чтобы осветить поле флуоресцентным светом. Если на теле клетки проявляются признаки маркировки, подайте ток еще на несколько секунд. Затем выключите ток и быстро оттяните эмбрион от микропипетки с помощью элементов управления столиком.

Если маркировка D-глаза не была очевидна, возможно, микропипетка была заблокирована и нуждается в замене. Если кончик пипетки зацепляется за другие ткани на корню клетки и окрашивает эту ткань, попробуйте слегка извлечь микропипетку и снова приблизиться к клетке, прежде чем прибегать к замене микропипетки по мере необходимости. Продолжайте мечение других клеток в том же эмбрионе или в других эмбрионах на том же предметном стекле.

Переместите наконечник к краю поля зрения и повторите процедуру. Удалите большую часть раствора в камере впрыска. Затем зафиксируйте эмбрионы, добавив 7,4% формальдегида PBS на 10 минут, после чего последует четыре промывки PBS.

Теперь препарат может быть преобразован в фотографию или смонтирован для конфокальной микроскопии с использованием описанного протокола. Заполненный dai интернейрон был безупречно преобразован в фотографии под оптику DIC. Пространственный контекст меченой клетки в немеченой окружающей ткани был хорошо разрешен

Например, положение тела клетки в коре головного мозга и проекция волокон в нейротаблетке могут быть видны в этом препарате. Капля красителя оказалась слишком большой. Несколько соседних клеток стали помечены одновременно, что затрудняет соотнесение отдельных проекций с отдельными телами клеток.

Также обратите внимание, что под флуоресцентным микроскопом разрешение фона значительно ниже без преобразования фотографий. Множественные клетки в соседних сегментах также могут быть введены в этот препарат, антитело против быстрых двух окрашиваний фалесов в нейротаблетке. Несмотря на наличие прозрачных клеточных тел, препарат проявляет возможный побочный эффект в виде длительных периодов фотоконверсии.

Клетки с более интенсивной меткой имеют тенденцию окрашиваться и начинают набухать по сравнению с мечением одной клетки с помощью конфокальной оптики. Мечение глаз красителем у эмбрионов, несущих репортерные конструкции GFP, может обеспечить пространственный контекст и идентичность заполненной D клетки в определенных популяциях GFP-положительных типов нейрональных или глиальных клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить и выполнять мечение одиночных нейронов в эмбриональной ЦНС после ПГН.

Но при попытке выполнить эту процедуру, пожалуйста, имейте в виду, что каждый шаг требует усилий, поэтому ожидайте пару повторений, пока вся процедура не пройдет гладко.