Идентификация Спящая красавица Транспозонов вставки в твердых опухолей с использованием Linker-опосредованного ПЦР

Эта процедура показывает, как идентифицировать новые онкогены и гены-супрессоры опухолей путем картирования транспонирования на вставках у мыши, которые стимулируют образование опухоли. Это достигается путем предварительного создания и сбора опухолей из трансгенной мышиной модели. Следующими этапами процедуры являются выделение опухолевой ДНК, проведение ПЦР, опосредованной линкером, затем секвенирование амплифицированных образцов ДНК и анализ транспонирования при вставках.

В конечном счете, процедура идентифицирует кандидаты в гены-драйверы опухоли. Основное преимущество использования линкерно-опосредованной ПЦР в сочетании с непредвзятым для генетического скрининга с использованием транспозонов спящей красавицы заключается в том, что мы можем легко идентифицировать новые генетические факторы рака. Всегда начинайте вскрытие с распыления на внешнюю сторону убитой мыши 70% этанола.

Собранные ткани и опухоли должны быть разделены на четыре участка размером от 50 до 100 миллиграммов. Зафиксируйте одну секцию в 10% буферном формине в течение 18 часов, а затем в 70% этаноле. Этот раздел может быть использован для окрашивания h и e и/или иммуногистохимии.

Остальные участки заморозьте в жидком азоте. Их можно хранить в морозильной камере и использовать для выделения D-N-A-R-N-A и белка для сбора ДНК из замороженного образца опухоли. Сначала мелко пропустите через мясорубку ткань с помощью бритвенного лезвия.

Далее переварите ткань в пробирке объемом 1,5 миллилитра с одним миллилитром буфера для лизиса клеток, и пятью микролитрами по 20 миллиграммов на миллилитр. Раствор протеазы К тщательно перемешать смесь и приступить к стандартной экстракции ДНК на основе изопропанола. Начните этот протокол с отжига линкеров в пробирке объемом 1,5 миллилитров.

Смешайте по 50 микролитров каждого раствора линкера с двумя микролитрами концентрированного хлорида натрия. Затем поместите трубку в термоблок с температурой 95 градусов Цельсия. Через пять минут выключите огонь и дайте ему медленно остыть до комнатной температуры, что может занять час или более после остывания.

Анальные линкеры можно хранить в морозильной камере до тех пор, пока они не понадобятся. Подготовьте 2 96-луночные планшеты по Али, цитируя один микрограмм ДНК из каждого образца в соответствующие лунки в обоих 96-луночных планшетах. Например, поместите один микрограмм ДНК из первого образца в лунку А одну из обеих луночных пластин.

ДНК в одном из 96-луночных планшетов будет расщеплена с помощью фермента NLA 3 с правой стороны, а образцы ДНК в другом 96-луночном планшете будут расщеплены с помощью фермента BFA с левой стороны. Дайте ДНК перевариться в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день закончите пищеварение нагреванием, инактивируя ферменты на 20 минут.

Теперь очистите реакцию пищеварения с помощью мини лута 96 лунки планшета. С помощью многоканальной пипетки перенесите каждый образец в мини-лут. Пластина на 96 лунок.

Поместите мини-пластину лута 96 лунки в вакуумный коллектор. Прикладывайте вакуум к пластине до тех пор, пока лунки не станут сухими. Как правило, 15 минут на протяжении всего этого протокола.

Необходимо проявлять большую осторожность, чтобы не загрязнить образцы. При работе с 96 луночными планшетами держите лунки максимально закрытыми крышками и избегайте пропускания пипетки через открытые лунки, потому что любая капля нежелательной жидкости может испортить образец. Снимите мини-пластину с вакуумного коллектора и закройте дно пластины бумажным полотенцем до полного высыхания.

Восстановите суспендию ДНК в мини лут. 96 луночной пластине, добавив в каждую по 30 микролитров дважды дистиллированной воды. Что ж, поместите мини-тарелку с добычей на орбитальный вибростенд, установленный на высокий уровень, на две минуты.

Затем перенесите содержимое мини-тарелки на 96 лунку. Для проведения реакций линкерного лигирования. Приготовьте реакцию лигирования, смешав достаточное количество буфера для лигирования, коленопреклоненные линкеры из стадии 3.2 Т, четыре ДНК-лигазы и воду в резервуаре с реагентами.

Используйте многоканальную пипетку для переноса 10 микролитров расщепленной ДНК с предыдущего этапа в новую 96-луночную пластину. Затем с помощью многоканальной пипетки Eloqua 10 мкл реакции лигирования во все лунки 96-луночного планшета. Ведь скважины были загружены ДНК и реагентами для лигирования.

Инкубируйте тарелку в течение четырех часов до ночи при температуре 16 градусов Цельсия. На следующее утро. Завершите лигирование, инактивировав Т-4 лигазу при температуре 65 градусов Цельсия на 10 минут.

Как и раньше, очистите реакцию лигирования с помощью мини-пластин и вакуумного коллектора, чтобы высушить пластину, а затем промокните дно пластины до полного высыхания. Ресуспендируйте ДНК в 30 микролитрах двойной дистиллированной воды. Поместите на орбитальный шейкер на две минуты, а затем переложите содержимое мини-тарелки на чистую тарелку.

Затем проведите второе расщепление ДНК с помощью bam H one, чтобы уничтожить оставшиеся транспозоны concat. Расщепляйте ДНК при температуре 37 градусов по Цельсию в течение трех-шести часов или в течение ночи, а затем переваривание очищается с помощью мини-пластин с добычей, следуя той же процедуре, что и раньше. Проведите 30-цикловую ПЦР с использованием праймера, специфичного для транспонирования, и праймера, специфичного для линкера.

Реакция должна содержать три микролитра переваренной ДНК с линкерами. Далее зачищаем реакцию ПЦР с помощью мини лута. 96 луночных планшетов и вакуумного коллектора, как это было выполнено ранее.

Восстановите суспендию ДНК в 30 микролитрах воды и перенесите суспензию в чистые 96 литров. Хорошо сыграно: разбавьте два микролитра продуктов ПЦР-реакции в 148 микролитрах воды двойной дистилляции, используя всего два микролитра разбавленных продуктов. Выполните 30 циклов ПЦР с использованием вложенных версий праймеров в объемах 100 микролитров.

Эти грунтовки предназначены для машины Illumina GA two X. Каждый образец будет иметь уникальный штрих-код из 12 пар оснований, полученный методом ПЦР, по 45 микролитров каждого продукта на 1% геле с бромидом AUM. Должен быть взят мазок продуктов ПЦР, представляющих собой ампликоны множества различных транспозонных вставок в опухоль.

С помощью ранее описанного метода вакуумной промывки очистите оставшиеся 50 микролитров ПЦР, затем повторно суспендируйте ДНК в 50 микролитрах воды и снова выполните вакуумную промывку. Теперь Резус, суспензируйте ДНК в 30 микролитрах TE и перенесите ее в чистую 96-луночную пластину. Определите концентрацию ДНК в каждом образце.

Затем объедините равное количество ДНК из каждого образца в одной пробирке. Можно секвенировать несколько сотен образцов ДНК за одну полосу прогона Illumina, при условии, что каждый образец был сгенерирован с использованием отдельного праймера со штрих-кодом в соответствии с протоколом. Успешный L-M-P-C-R должен амплифицировать сотни транспонций на вставках в одной опухоли после введения половины вторичного продукта ПЦР на 1%-ный гель, мазок ДНК представляет эту амплификацию.

Если ЛМ-ПЦР не увенчалась успехом, мазок ДНК будет отсутствовать. Вместо этого вы увидите окончательные полосы ДНК, секвенирующие от одной до 200 опухолей в одной полосе платформы Illumina GA two X, которая должна произвести более 30 миллионов последовательностей по 100 пар оснований каждая При попытке выполнить эту процедуру. Важно помнить, что работать нужно медленно и осторожно, чтобы убедиться, что после этой процедуры не произойдет загрязнения.

Анализ недавно обнаруженных генетических факторов рака может быть проведен для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие из этих факторов могут быть мишенью для терапии?