MultiBac белкового комплекса добывающей платформы на EMBL

Общая цель этой процедуры заключается в получении белковых комплексов с использованием системы клеток насекомых с помощью многоканальной системы клеток вируса баула. Это достигается путем создания многогенной конструкции, кодирующей выбранный белковый комплекс. Вторым шагом является создание композитного вируса баулы, который содержит мультигенную конструкцию путем трансформации бактериальных клеток и скрининга правильной средней части спины.

Затем изолируйте вирусный геном баулы и используйте его для заражения клеток насекомых в небольших масштабах в шестилуночной пластине после тестирования на выработку белка. Выбранный белковый комплекс экспрессируется в более крупном масштабе и очищается. В конечном счете, очищенный белковый комплекс используется для изучения его структуры и функции и, возможно, для разработки лекарств.

Основные преимущества этой методики перед существующими эховирусными системами двояки. Комплексы MultiPro могут быть изготовлены с беспрецедентными качествами. Кроме того, производимый материал имеет гораздо более высокое качество, потому что мы разрабатываем эховирус для оптимального производства белка.

Применение этого метода выходит далеко за рамки основных биологических вопросов. Наша платформа Multi Bag успешно используется для производства белков, которые являются многообещающими новыми вакцинами-кандидатами от различных заболеваний, а также для стимулирования исследований рака за счет производства ключевых белковых сборок, вызывающих рост опухоли. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с процессами и потребностью в стерильности.

Поэтому мы очень усердно работали над установлением стандартных операционных процедур, чтобы сделать применение мультибанкинга максимально простым для пользователей, не являющихся специалистами. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку шаги робота гораздо легче понять, когда процесс показан в движении. Вы не можете извлечь это, просто глядя на протоколы, которые записаны, независимо от того, насколько они подробны.

Прежде чем начать эту процедуру, важно тщательно спланировать стратегию коэкспрессии. Рекомендуется сначала смоделировать эксперимент. In silico.

Гены должны быть распределены по акцепторной и донорской плазмидам. Лучше всего сгруппировать субъединицы, которые могут образовывать физиологические субмодули. Поскольку большие комплексы имеют много белковых субъединиц, многие гены должны экспрессироваться одновременно.

Система Multi Back значительно упрощает клонирование генов за счет использования автоматизированных процедур для размещения генов в небольших молекулах-предшественниках ДНК, которые содержат короткую последовательность ДНК, называемую блоками P, которая распознается ферментом рекомбиназы кри. Затем эти предшественники объединяются в одномоментную реакцию путем добавления предварительной рекомбиназы, которая объединяет все, что имеет сайт L P локса, в одну большую ДНК-плазмиду. Эта мультигенная конструкция впоследствии встраивается в геном вируса с несколькими задними булами.

Если необходимо создать большое количество конструкций, рекомендуется использовать роботизированные скрипты и рабочую станцию для работы с жидкостями. Рабочее место оснащено вакуумом для мини-препоса и ПЦР-очистки, ЭЭЛ для автоматической загрузки ПЦР-проб. Термоамплификатор для ПЦР и инкубационных ступенчатых ступеней, шейкер для реактивной суспензии клеток и холодных блоков.

Что касается ферментов, то представляющие интерес гены вставляют в выбранные доноры и акцепторы с использованием ферментов рестрикции и лигазы или, в качестве альтернативы, с использованием независимых от лигирования методов, валидируют все донорские и акцепторные конструкции, клонируют с помощью рестрикционного картирования и секвенирования. Продолжайте диффузные комбинации акцепторов доноров с помощью рекомбинации CRE LAX P для получения выбранных конструкций экспрессии нескольких генов. Собранные мультигенные конструкции проверяются с помощью аналитических реакций ПЦР со специально разработанными наборами праймеров.

Здесь показаны снимки процесса TR с помощью робота. Они включают в себя подготовку ПЦР-реакций в многолуночных планшетах, получение матричных ДНК и праймеров, ПЦР-амплификацию ДНК и получение мультигенных конструкций, выращенных в бактериальной культуре методом щелочного лизиса в многолуночных планшетах. Чтобы начать эту процедуру, интегрируйте векторы переноса нескольких генов в вирусный геном multi bula путем трансформации в клетки DH 10, содержащие вирусный геном и функции, необходимые для транспозиции TN 7.

После того, как TN семь транспозиционных клеток с композитным вирусом баула, содержащими представляющие интерес гены, отбираются с помощью сине-белого скрининга, успешная транспозиция TN seven приводит к потере альфа-комплементации бета-галакто. Таким образом, колонии с правильной транспозицией TN 7 остаются белыми на селективных APL, содержащих xal. Подготовьте бактериальные культуры из белых колоний и выделите бэкин щелочным лизисом и осаждением этанола изопропанола.

Затем трансфицируют клетки насекомых с очищенным вирусным геномом бао, работая в стерильном колпаке с семенами аликвот логарифмической фазы SF 21 клеток насекомых в шестилуночной тканевой культуральной тарелке. К каждому хорошо добавить очищенный вирусный геном бао и реагент для трансфекции, смешанный в питательных средах. Инкубируйте трансфицированные клетки при температуре 27 градусов Цельсия без движения в течение 48–60 часов.

Через 48 – 60 часов соберите первоначальный вирус или V ноль, удалив среду, пополните ее свежими средами и верните тарелку в инкубатор через два-три дня, проведите тест на выработку белка. И если присутствует маркер YFP, проведите тест на флуоресценцию для амплификации вируса. Используйте исходный вирус V zero для заражения от 25 до 50 миллилитров клеток в логарифмической фазе в небольших колбах-шейкерах Эрленмейера, взбалтываемых на орбитальной платформе.

Шейкер подсчитывает ячейки и разделяет их каждые 24 часа, пока они не перестанут удваиваться. Соблюдайте режим низкой кратности инфекции или MOI, клетки должны удвоиться хотя бы один раз, в противном случае повторите эксперимент с добавлением V ноль в меньшем объеме. На изображении слева показаны неинфицированные клетки насекомых после заражения вирусом multi back baula.

Инфицированные клетки насекомых перестали размножаться и увеличились в размерах, как показано на изображении справа. Через 48–60 часов соберите вирус Vone путем гранулирования клеток. Извлеките и сохраните носители с вирусом.

Резус суспензирует клетки со свежими средами и переносит их обратно в колбу Эрленмейера. Удаляйте от одного раза до шести клеток каждые 12 или 24 часа с помощью гранулирования и проверяйте выработку белка и сигнал маркерного белка, если требуется больший объем экспрессии. Дальнейшее усиление вируса путем заражения до 400 миллилитров клеток в двухлитровых колбах-шейкерах вирусом Vone one.

В соответствии с режимом низкого MOI, мы настоятельно рекомендуем хранить вирус Vone в качестве производственного вируса с использованием инфицированных улярным вирусом клеток насекомых или методов VIC для предотвращения модификаций рекомбинантного вируса и сохранения высоких уровней экспрессии. Через 24 часа после остановки пролиферации наблюдаются инфицированные гранулированные клетки. На этой стадии клетки содержат целые вирусные частицы непосредственно перед тем, как они будут выпущены в среду.

Удалите среду, ресуспендируйте клеточную гранулу в замораживающем растворе и проведите замораживание BIIC в криопробирках для производства белка. Используйте V one V two или замороженные аликвоты BIC для заражения более крупных клеточных культур. Обычно 400 миллилитров в двухлитровых колбах придерживаются режима с низким MOI.

Регулировка объема вируса, используемого для заражения, таким образом, чтобы зараженная культура удвоилась по крайней мере один раз. Если присутствует белок-маркер YFP, извлеките его один раз по 10 из шести клеток через определенные промежутки времени, произведите ультразвуковую обработку и центрифугирование клеток и перенесите на 96-луночный планшет для измерения уровней YFP в стандартном 96-луночном планшете, способном регистрировать флуоресцентные сигналы. что указывает на максимальную выработку рекомбинантного белка. Собирайте клетки на этой стадии, храните клеточные гранулы при температуре минус 20 градусов Цельсия в краткосрочной перспективе или при температуре минус 80 градусов Цельсия в долгосрочной перспективе, клетки должны быть заморожены методом, адаптированным к потребностям белка, а затем цитозоль и ядра.

Фракционированные ядерные белки обычно содержатся в ядерной грануле. В то время как цитозольные белки остаются в цитозоле. Очистка белка значительно упрощается за счет фракционирования.

Так как за одну стадию центрифугирования можно удалить много загрязняющих веществ. Белковые комплексы могут быть удобно очищены из небольших исходных клеточных культур с использованием миниатюрных методов очистки, таких как многолуночная или микрозондовая очистка. В сочетании с малообъемными хроматографическими системами, такими как ACTA micro, будущим шагом будет миниатюризация и интеграция всей экспериментальной установки в небольшое настольное приложение, которое взаимодействует с рабочей станцией клонирования.

Здесь показан микромасштабный робот периодического действия, который в настоящее время находится в стадии разработки и будет использоваться для этой цели. Сильная коэкспрессия гетерологичных белков достигается с помощью системы multi back, как показано здесь. Сверхэкспрессированные белковые запреты четко различимы в экстракте всей клетки, WCE и очищенном лизате.

Качество и количество производимого белкового материала часто бывает достаточным. Обеспечьте структурированное определение белковых комплексов, таких как митотический комплекс контрольных точек MCC, показанный на этой диаграмме. Часто выход этих аналитических циклов очистки достаточен для анализа структуры и функции очищенного комплекса различными способами, в том числе электронной микроскопией.

Стандартные операционные процедуры, которые мы разработали, позволяют неспециалистам легко применять наш подход, а наша технология может быть использована во многих лабораториях, заинтересованных в больших белковых комплексах, так же, как это происходит сегодня с маленьким белком в Nikola. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать мультипакеты, чтобы производить интересующие вас белковые комплексы в непревзойденном количестве и качестве для ваших амбициозных исследовательских целей. Работа с нашими системами не требует особых условий безопасности.

Однако имейте в виду, что вирус заразит вас, если вы будете небрежны, даже если он не будет размножаться в ваших клетках. Таким образом, осторожное обращение со стероидными заболеваниями является обязательным условием при выполнении этой процедуры. Наш метод стал достаточно популярным уже более чем в 600 лабораториях по всему миру.

Воспользуйтесь нашей методикой. Мы верим, что в будущем наш метод станет неотъемлемой частью широкомасштабных усилий по структурной геномике, направленных на работу со сложной зоной человека. Это может помочь выявить основу болезней и в долгосрочной перспективе привести к новым и лучшим лекарствам и методам лечения.