Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Общая цель данного эксперимента заключается в измерении механических свойств эндотелиального гликокаликса с помощью атомно-силового микроскопа или FM. Это достигается путем первого культивирования монослоя эндотелиальных клеток под физиологическим потоком в биореакторе с целью наращивания слоя гликокаликса в качестве второго этапа. Шарики микронного размера прикреплены к FM-кантилеверам и используются в качестве зонда для измерения силы сопротивления тела клетки и гликокаликса во время индентирования. Затем кривые вдавливания подгоняются к двухслойной модели, чтобы определить модуль гликокаликса, и получены результаты толщины, которые показывают, что эндотелиальный гликокаликс имеет модуль 0,7 килопа и толщину 380 нанометров на основе двухслойного анализа.

Здравствуйте, меня зовут Рик Ва.Я заведующий кафедрой биомедицинской инженерии в Университете Рочестера. В последние годы было много дискуссий о возможной роли эндотелиального гликокаликса в воспалении, в частности, о том, может ли он действовать как защитный барьер для предотвращения нежелательной адгезии клеток во время воспаления. Одним из ключей к решению вопросов, которые окружают эту проблему, является возможность измерения физических свойств, а именно толщины и жесткости этого слоя, как в нормальных условиях, так и во время воспалительной реакции.

Меня зовут Грэм Марш. Я учусь в аспирантуре факультета биомедицинской инженерии Рочестерского университета. Большая проблема в характеристике эндотелиального гликокаликса заключается в том, что он невероятно мягкий.

Подход, который мы придумали, заключается в том, чтобы прикрепить большой валик к кончику консоли A и A FM так, чтобы измеренные силы были разрешимы с помощью А, FM.To начать эту процедуру, построить проточную камеру, подобную показанной здесь, способную выращивать ячейки при напряжении сдвига 1,0 Паскаля. Подготовьте проточную камеру к эксперименту, предварительно очистив стекла в растворе пираньи в течение 15 минут. Промыть их трижды дистиллированной водой и высушить при температуре 70 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем покройте предметные стекла аминопропилтрикси, сай лейн или апте путем осаждения из паровой фазы. Добавьте один миллилитр апте в колбу, которая прикреплена к вакуумной камере с образцом. Затем закройте колбу крышкой и потяните вакуум 0,7 бар в течение одного часа.

За это время обновите пылесос три раза. Далее вырежьте новую прокладку проточной камеры из листа силикона толщиной 0,4 миллиметра с помощью режущего инструмента Silhouette SD. Канал имеет размеры 6,4 миллиметра в ширину и 19 миллиметров в длину, а внешний диаметр обрезан до 35 миллиметров, чтобы он поместился в тарелку для культуры убежища.

Используя эти размеры, рассчитайте скорость потока, необходимую для создания абсолютного напряжения в один Паскаль с помощью показанного здесь уравнения. Q представляет расход. Тау – это чистый стресс.

Му – это вязкость среды. H — высота канала, а W — ширина проточной камеры. Следующим шагом является выравнивание верхней части проточной камеры с прокладкой в чашке для клеточных культур и закрепление ее магнитным кольцом.

Подсоедините проточные отверстия в чашке для клеточных культур к трем волновым клапанам с линиями к 30-миллилитровым шприцам. Затем простерилизуйте весь узел путем промывки изопропиловым спиртом в течение пяти минут. Затем удалите спирт и дайте ему высохнуть на воздухе в ткани.

Культуральный капюшон Подогрейте 4% сыворотку плода телят в среде McCoy's до 37 градусов Цельсия. После того, как вы дадите высохнуть в течение пяти-10 минут, смойте остатки алкоголя 30 миллилитрами предварительно теплой сыворотки для телят плода. Затем наполните шприцы 20 миллилитрами питательной среды veek MCDB 1:31.

Далее закройте шприцы крышками, чтобы предотвратить загрязнение. При перемещении системы из стерильного колпака установите колпачок для улавливающего резервуара с иглой, которая проникает в жидкость для забора среды обратно в резервуар выше по течению. Наконец, прикрепите стерильные фильтры 0,2 микрона к воздухозаборникам на крышках следующего забора пупочной вены человека.

Эндотелиальные клетки, выращенные до слияния в колбе с Т-25. Повторно суспендируйте гранулированные клетки при концентрации 100 000 клеток на миллилитр в среде и наберите раствор в шприц. Затем впрыскивают суспензию в проточную камеру через трехходовой клапан.

Дайте ячейкам осесть и прилипните к стеклянной подложке в течение двух часов. Перед началом потока переместите биореактор и клетки в инкубатор, где клеткам дают осесть и прилипнуть в течение двух часов. Трубка, соединяющая резервуары с перистальтическим насосом, проходит через заднюю часть инкубатора После того, как ячейки прилипли, установите перистальтический насос на желаемый расход.

Среда перемещается между резервуарами, создавая напор и поток через биореактор, который создает напряжение сдвига стенки в один Паскаль. Дайте клеткам инкубироваться при непрерывном потоке при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-пяти дней, пока камера не слится. Чтобы начать подготовку кантилевера, очистите наконечник плюс консоль FM в азотной кислоте на пять минут, после чего промойте дистиллированной водой.

После высыхания функционализируйте кантилевер с помощью apdi в камере осаждения из паровой фазы, как было показано ранее для предметных стекол. Затем приготовьте раствор из пяти миллиграммов на миллилитр по весу NHS Sulf O lc, биотина в буферном растворе соли Хэнка. Погрузите консоли в раствор на 15 минут.

Эта реакция конъюгирует CY и конечный гидроксиоксид и представляет молекулы биотина на поверхности консолей. Накануне начните приготовление раствора среды, не содержащей биотина, соединив 20 миллилитров питательной среды vexcel, содержащей 20% сыворотки, с 200 микролитрами гранул с покрытием STREPT ENC, и инкубируйте в течение 12 часов при вращении. В день проведения эксперимента.

Потяните магнитные шарики на дно пробирки с помощью магнита на две минуты и перенесите надосадочную жидкость, содержащую среду, не содержащую биотин, в новую пробирку. Простерилизуйте фильтрующий материал, пропустив его через фильтр 0,22 микрометра, и поместите его в новую пробирку. Следующим шагом является снятие проточной камеры с чашкой для клеточных культур, а затем трижды промывка клеток двумя миллилитрами 37 градусов Цельсия, средой без биотина.

Затем добавьте один микрограмм диаметром 2,4 микрометра, очищенные бусины с покрытием Aden. Добавьте концентрацию 10 микрограммов на миллилитр в чашку для клеточной культуры и аккуратно перемешайте. Затем откалибруйте тиб A FM, прикрепив его к штифтовой бусине и вдавив его в обычную стеклянную поверхность.

Для этого приземлите кончик на стеклянную поверхность рядом с бусиной, втяните кончик, затем поместите вершину консоли над бусиной и нажмите на нее в течение нескольких секунд. Наконец, используйте откалиброванный консоль для вдавливания образцов. Шарики размером 2,4 микрометра обеспечивают большую площадь контакта с поверхностью клетки, что позволяет легче определить механические свойства мягкого слоя гликокаликса.

Чтобы достичь этого положения, кантилевер над клеткой рядом с ядром клетки, используйте мягкое приближение кончика к клетке, чтобы установить высоту кантилевера примерно на три микрометра над поверхностью клетки. Затем сделайте вдавливание в поверхность 20 раз со скоростью один микрометр в секунду до максимальной силы 7. Наноньютоны позволяют пройти шесть секунд времени между последовательными контактами.

Рассчитайте толщину слоя гликокаликса с помощью уравнений, относящихся к теории Герца. Сила вдавливания F описывается этим уравнением, где дельта — глубина вдавливания. R — радиус сферы, а estar — комбинированный модуль упругости материалов, находящихся под напряжением.

Чтобы разделить объединенный модуль упругости estar на клеточный и гликокаликсовый компоненты, рассмотрим слой гликокаликса как однородную, тонкую мягкую пленку на поверхности тела клетки и используйте двухслойную модель Клиффорда, и C.In этом уравнении PQ и N будут константны эмпирически из полимерных соответствий. M — это константа из полимерной модели, а Z связана с толщиной тонкой пленки или слоя гликокаликса по показанному здесь уравнению. Сила, измеряемая с помощью A FM, измеряемая в наноньютонах, начинает увеличиваться после контакта с поверхностью и первоначально в ней доминирует компонент слоя гликокаликса.

Как только слой гликокаликса сжимается, тело клетки становится основным компонентом деформации. Синяя двухслойная линия аппроксимации была рассчитана путем подгонки четырех свободных параметров, чтобы она соответствовала данным об отступе, показанным красным цветом из используемого уравнения. Свойства из 25 ячеек были скомпилированы в гистограмму, показанную здесь.

Средний модуль модуля слоя гликокаликса был определен равным 0,7 плюс-минус 0,5 кипа-кал, а толщина слоя гликокаликса была определена равной 380 плюс-минус 50 нанометров. Такой подход дает нам инструмент, необходимый для ответа на фундаментальные вопросы о роли гликокаликса в регулировании клеточной адгезии во время воспаления. Теперь мы можем ответить на вопросы о том, как свойства гликокаликса изменяются во время воспаления.

С помощью каких средств осуществляются эти изменения. Этот подход может быть расширен несколькими способами. Например, его можно использовать для проверки новых, более сложных теоретических описаний свойств гликокаликса.

Или, на более практическом уровне, можно было бы использовать это для тестирования поверхностных покрытий, вдохновленных биологией, предназначенных для защиты имплантируемых устройств от иммунного ответа в организме хозяина. Большое спасибо за проявленный интерес к нашей работе.