Optogenetic активации нейронов данио рерио Соматосенсорные использованием шеф-tdTomato

Общая цель этой процедуры заключается в активации одиночных соматосенсорных нейронов у личинок рыб данио. Для этого сначала подготавливается оптический кабель и он подключается к синему лазеру A-D-P-S-S. Вторым шагом является инъекция трансгена в один-два эмбриона на клеточной стадии.

Затем отсеивают жировые эмбрионы, экспрессирующие C-H-E-F-T-D томат в соматосенсорных нейронах, и монтируют их в себя. Последним шагом является подача короткого импульса синего света для активации одного нейрона и запись результирующего поведения. Основное преимущество этой техники из существующих методов, использующих корневой канал Вариант 2, заключается в том, что этот подход может быть использован для вызова поведенческих реакций от отдельных нейронов, активированных по крайней мере через четыре дня после госпитализации.

Тем не менее, этот метод используется для того, чтобы дать представление о функции конкретных соматосенсорных нейронов у личинок данио-рерио. Этот подход также может быть адаптирован для изучения поведения, вызванного любой популяцией нейронов рыбок данио, таких как внутренние нейроны или моторные нейроны. Этот генетический подход может быть использован для активации конкретных нейронов in vivo, характеристики функционального развития, оценки влияния мутаций или феноменологической блокады конкретных белков на поведение и картирования нисходящих нейронных сетей, ведущих к различным поведенческим реакциям.

Чтобы начать эту процедуру, создайте накопитель для оптического кабеля, расплавив коническую горловину стакана. Макароны пипеткой нанесите на банки и конфорку, чтобы сделать угол 150 градусов. Далее с помощью кусачек или лезвия бритвы аккуратно разрежьте оптический кабель на две части.

Каждая деталь должна иметь один открытый конец и один конец с адаптером FC PC. Затем зачистите оптический кабель вплоть до облицовки, сняв оптоволоконную оболочку, укрепив волокна и покрыв от 5,0 сантиметров отрезанного конца кабеля. После этого вставьте оптический кабель в подготовленную пипетку для пасты.

Убедитесь, что кабель может легко входить и выходить из наконечника пипетки с помощью алмазного стеклореза или щипца с тонким наконечником. Зарежьте стекловолокно и отломите конец, чтобы на конце волокна получился чистый разрез. Далее втяните оптический кабель в пипетку для пасты.

Затем поместите оптический кабель в макаронную пипетку с помощью микроманипулятора под микроскопом, вручную обработайте от 24 до 48 эмбрионов HPF с помощью пары щипцов, обезболите личинок с помощью 0,02% трики с помощью флуоресцентного препарирующего микроскопа. Идентификация личинок с помощью нейрона Рона Бирда или нейронов тройничного нерва Эмбрионы с редкой экспрессией в легко идентифицируемых клетках являются оптимальными, но отдельные нейроны будут нацелены на активацию с помощью оптоволоконного кабеля, поэтому приемлем широкий диапазон плотности экспрессии. Переложите личинок в новую посуду со свежей водой из голубого зародыша ПТУ.

Храните эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия в темноте до желаемой экспериментальной стадии. В этом разделе приготовьте мальтазу с низким содержанием 1,5% и двойную дистилляцию и храните в термоблоке при температуре 42 градуса Цельсия, чтобы предотвратить его затвердевание. С помощью стеклянной пипетки для макарон перенесите одну из личинок предварительного просеивания в пробирку с 1,5%-ным низким содержанием таяной агарозы с как можно меньшим количеством синей эмбриональной воды.

Затем переложите личинку в капле агарозы на небольшую чашку Петри. Под препарирующим микроскопом расположите лаву спинной стороной вверх, когда арос затвердеет. Используйте тонкое лезвие бритвы, чтобы отрезать арос с обеих сторон лавы.

Заполните территорию вокруг ароса зародышем голубой водой. Затем сделайте два диагональных надреза с обеих сторон желтка, стараясь не поцарапать лаву. После этого оттяните арос от ствола и хвоста лавы.

Теперь установите высокоскоростную камеру на препарирующий эндоскоп и подключите камеру к компьютеру. Затем включите компьютер и высокоскоростную камеру. Откройте программное обеспечение для работы с видео и отрегулируйте параметры камеры.

Далее соедините оптический кабель, лазер и стимулятор вместе. Затем включите стимулятор и установите его на максимум пять вольт и длительность импульса в пять миллисекунд. Впоследствии включите лазер.

Затем с помощью флуоресцентного препарирующего микроскопа расположите кончик оптического кабеля рядом с телом нейронной клетки с экспрессией томата C-H-E-F-T-D. Подайте импульс синего света для активации сенсорного нейрона. Затем запишите ответы с помощью высокоскоростной камеры.

Установите частоту 500 или 1000 кадров в секунду и повторите эксперимент по крайней мере с одной минутой между активациями, чтобы избежать привыкания, выпустить предыдущую часть лавы, Арис с помощью щипцов, и будьте осторожны, чтобы не поранить животное. Затем переложите его в свежую голубую зародышевую воду. Животным можно дать возможность развиваться дальше, и процедуру можно повторять на более старых стадиях.

Эмбрион также может быть повторно установлен для конфокальной визуализации активированной клетки с высоким разрешением, чтобы коррелировать поведение с клеточной структурой. Лавовая диаграмма данио-рерио, изображенная здесь, частично установлена из 1,5% солодового Aris, представленного пунктирными линиями, окружающими ее ростральную часть. Нейрон тройничного нерва и нейрон бороды Рохана изображены красным ртом, клетки обведены пунктирными линиями на иллюстрации.

Вот фильм, показывающий, что активация одного нейрона бороды Рохана, экспрессирующего помидор C-H-E-F-T-D примерно в 35 HPF-лаве, вызывает поведенческую реакцию. В этом фильме показана активация нейронов бороды Рохана томата C-H-E-F-T-D в лаве 60 HPF, а в этом фильме показана активация нейронов бороды Рохана в лаве с четырьмя DPF после освоения. Этот генный подход может быть выполнен менее чем за один час.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как активировать отдельные нейроны и личинки рыб-Весов в различные моменты времени. Не забывайте, что работа с лазерами может быть чрезвычайно опасной и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать надлежащие меры предосторожности.