Выделение и дифференциация стромальные клетки сосудов в бежевый / Brite клетки

Общая цель этой процедуры заключается в выделении первичных адипоцитов и индуцировании их дифференцировки в культуре до бежевых или ярких клеток. Первым делом необходимо вскрыть жировую ткань у мышей. Далее ткань переваривается коллагеназой.

После того, как сосудистая фракция стромы выделена, клетки пластинчатся. Заключительным этапом является индуцирование дифференцировки клеток в бежевые или яркие клетки. В конечном счете, аналитические методы используются для того, чтобы показать повышенную экспрессию генов, специфичных для коричневых адипоцитов.

Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в бурых жировых тканях, а именно, какой молекулярный механизм регулирует развитие ярких или белых клеток. Применение этого метода распространяется на лечение ожирения и других заболеваний, связанных с образом жизни. Поскольку манипуляции с бурой жировой тканью у человека могут быть использованы в качестве потенциального терапевтического вмешательства, первым шагом является подготовка среды для пищеварения.

Затем после эвтаназии жировая ткань удаляется. Сначала изолируйте межлопаточную коричневую жировую ткань или летучую мышь, разрезав вдоль спины животного до самой шеи. Две доли коричневой жировой ткани можно найти прямо под кожей между плечами.

Далее аккуратно снимите тонкий слой белого жира, покрывающий летучую мышь. После изоляции поместите салфетку непосредственно в чистую PBS. Паховая белая жировая ткань или ват находится непосредственно под кожей с обеих сторон.

Он распространяется на внутреннюю сторону бедер и вниз к яичкам. Извлеките салфетку и поместите в чистую PBS. Следующие шаги применяются как к летучим мышам, так и к влажным образцам.

Быстро удалите все загрязнения, такие как волосы, скелетные мышцы и соединительная ткань с участков тканей. Далее быстро высушите ткань на бумажном полотенце, чтобы предотвратить разбавление диссекционной среды PBS и положите ее на сухую тарелку. Добавьте питательную среду и пропустите через мясорубку ткань на мелкие кусочки.

Затем перенесите ткань в 50-миллилитровую трубку, содержащую остальную среду для пищеварения. Поместите пробирку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с постоянным перемешиванием на 40-50 минут для переваривания. Проверяйте каждые 10-15 минут, чтобы убедиться, что пищеварение идет хорошо, и предотвратить переваривание.

После того как ткань хорошо переварится, остановите пищеварение. Добавив пять миллилитров готовой среды и хорошо перемешав, клетки должны стать практически полностью однородными. Затем центрифугируйте образец при 700-кратном G в течение 10 минут.

Стромально-сосудистая фракция теперь должна быть видна в виде коричневатых гранул на дне трубки, которые аспирируют маслянистый зрелый слой адипоцитов сверху и большую часть жидкого слоя. Далее растворяем гранулы в 10 миллилитрах, готовим среднюю и хорошо перемешиваем. После смешивания поместите клеточный фильтр на новую 50-миллилитровую трубку и отфильтруйте клеточную суспензию.

Перелейте отфильтрованную суспензию клеток в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 700-кратном G в течение 10 минут. Далее отсасывайте среду и снова суспендируйте гранулу. В 10 миллилитрах полной средней пипетки и хорошо перемешайте пластины клеток по мере необходимости.

Как правило, из пяти мышей получаются две 10-сантиметровые пластины пахового вата и одна пластина летучей мыши. Через один-два часа после нанесения покрытия. Отсадите среду, дважды промойте PBS и добавьте свежую среду.

Этот шаг важен, так как он может удалить эритроциты, иммунные клетки и другие загрязняющие вещества. Технические и индукционные среды подготавливаются заранее. После того, как первичные адипоциты вырастут до 95-97% конфлюенции, замените обычную полную среду на индукционную среду.

Через 48 часов смените среду на поддерживающую среду, содержащую 0,5 микромолярного глитазона RO. По прошествии еще 48 часов замените на свежую поддерживающую среду, содержащую один микромолярный глитазон RO, еще на два-три дня. Капли появляются примерно через три-четыре дня после индукции, как показано здесь, через шесть-семь дней после первого добавления индукционной среды.

Клетки должны быть полностью дифференцированы до зрелых жировых клеток и должны быть заполнены масляными каплями. Теперь клетки могут быть собраны и использованы для дальнейшего анализа. Потемнение первичных адипоцитов можно оценить путем измерения мРНК специфичных или селективных генов бурого жира по Q-R-T-P-C-R, как показано здесь.

RO-глитазон, надежно индуцированный UCP с экспрессией одной мРНК FORSKOLIN, обозначенный здесь как циклический А МП. Дальнейшее увеличение глитазона RO индуцировало одну экспрессию UCP. Кдиа. Другой селективный ген бурого жира также был надежно увеличен дозозависимым образом. Лечение RO-глитазоном также увеличивало экспрессию FABP 4 и адипогенного маркера как для бурого, так и для белого жира.

Этот эффект потемнения был обусловлен не только усилением адипогенеза как такового. Поскольку индукция экспрессии UCP one и CDIA все еще была значительной, даже если уровни мРНК нормализовались до уровня FABP 4, этот вестерн-блот подтверждает повышенный уровень белка UCP one. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять преадипоциты и как дифференцировать эти клетки в бежевые или яркие клетки в культуре.