Онлайн-клеточной видео микроскопия грибкового патогена Фагоцитоз

Общей целью данной процедуры является проведение эксперимента с видеомикроскопией живых клеток для изучения фагоцитоза грибкового патогена человека Candida albicans. Это достигается за счет первой культуры у Candida albicans за одну ночь, поэтому они вступают в неподвижную фазу. Следующим шагом будет нанесение 7 74 макрофагов в 35-миллиметровые чашки со стеклянным дном и культивирование их в течение ночи.

На следующий день Candida albicans окрашивают чувствительным к pH Zi, а кислые органеллы макрофагов окрашивают с помощью лизотрекера красного цвета. Заключительным этапом является видеосъемка анализа на фагоцитоз, в котором макрофаги J 7 7 4 культивируются с Candida albicans. В конечном счете, полученное видео может показать стадию тихоокеанского анализа распознавания миграции макрофагов, поглощения и созревания зоны FGA.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как иммуноцитохимия, заключается в том, что видеомикроскопия в реальном времени может быть использована для разбивки наблюдаемых различий на отдельные стадии, такие как миграция, поглощение и созревание фагосом, которые могут быть затронуты. Дифференциально, хотя этот метод может дать представление о фагоцитозе канадского акана. Он также может применяться к другим системам, таким как другие патогены, фагоциты, включая дендритные клетки и нейтрофилы.

Эта культура требует заблаговременной подготовки агаровых пластин СК минус U. Их можно хранить в холодильнике, начиная с нанесения полос серотипа Candida albican, штамма CI 4 плюс CLP 10 из запасов глицерина, хранящихся при температуре минус 80 градусов Цельсия, на агаровую пластину SC U. Инкубируйте планшет при температуре 30 градусов Цельсия до образования колоний обычно в течение 48 часов.

На этом этапе пластина может храниться при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не будет готова к использованию. Теперь выберите одну колонию и обработайте ее в пяти миллилитрах, SCU или средней за ночь при 30 градусах Цельсия на коромысле, установленном на 200 оборотах в минуту. Это приведет к образованию кандиды альбиканов в стационарной фазе.

Добавьте 10 микролитров культуры Candida albicans на ночь к 990 микролитрам PBS при pH 7,4 и проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра для визуализации Candida albicans во время анализов фагоцитоза, окрашивание 100 миллионов кандид с помощью Zi в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Затем удалите несвязанную фитцу, промыв candida albicans три раза в PBS, чтобы промыть центрифугой кандиду при 3000 G в течение пяти минут. Удалите суп и снова суспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS Reese.

Конечную гранулу суспендировать в PBS в концентрации 1 миллион клеток на микролитр. Для этого протокола подготовили культуру J 7 7 4 0,1 макрофагов в 75-сантиметровых квадратных тканевых культуральных колбах в дополненном DMEM при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом из колбы. Отбракуйте макрофаги и перенесите их в 50-миллилитровую пробирку Falcon Centrif.

Используйте макрофаги в 600 умноженных на G в течение пяти минут, чтобы получить клеточное нёбо. Снимите супинат и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах довоенной добавки DM dmm. Теперь подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и поместите 1 миллион клеток в 35-миллиметровую стеклянную чашку для визуализации с двумя миллилитрами дополненной среды DMM.

Инкубируйте блюдо в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и с 5% углекислым газом на следующий день. Перед визуализацией замените дополненную среду DMM двумя миллилитрами предварительно подогретой независимой от углекислого газа среды, содержащей один микромоляр Liso tracker red DND 99, и те же добавки, что и DMM. Микроскоп должен включать в себя инвертированный предметный столик и климатическую камеру, нагретую до 37 градусов Цельсия, а также фильтры для возбуждения для выбранных пятен fitzy и trixy.

В этом примере используется прикладное прецизионное ядро дельта-зрения. Сначала включите нагреватель микроскопа, чтобы контрольная камера прогрелась до 37 градусов по Цельсию. Затем включите микроскоп и компьютер и загрузите программное обеспечение для визуализации, установите чашку для визуализации на предметный столик микроскопа и отрегулируйте фокус для поиска макрофагов J 7 74 0,1.

Оптимизируйте внешний вид изображений trixi и DIC, регулируя процент пропускаемого света и время экспозиции. Снимите чашку для визуализации и добавьте в чашку 3 миллиона окрашенных candida albicans. Запишите время и верните блюдо на сцену, при необходимости оптимизируйте внешний вид удачных изображений и настройте точки интереса в программном обеспечении для обработки изображений, если это необходимо.

Теперь приступайте к визуализации, когда все точки находятся в фокусе и каналы оптимизированы. Снимайте изображения fitzy, trixi и DIC каждую минуту в течение шести часов. Это самый ответственный этап в процедуре.

Для правильной настройки микроскопа требуется время. Если фильмы недоэкспонированы или переэкспонированы, или если они не в фокусе, они будут непригодны для использования, и эксперимент придется повторить. На этом репрезентативном видео показано поглощение Candida albicans линией мышиных макрофагов J 7 74 0,1.

Во время шестичасового эксперимента видеомикроскопии живых клеток candida albicans в зеленый цвет окрашивали с использованием чувствительного к pH красителя fitsi, который гасился во время подкисления фагосомы макрофага. Таким образом, подтверждая, когда кандиды были интернализованы, кислотные компартменты макрофагов окрашивали красным флуоресцентным красителем. Обратите внимание на различия в количестве Candida albicans, проглоченных отдельными J 7 74 0,1 макрофагами в этом эксперименте, 82% J 7 74 0,1 макрофагов поглотили по крайней мере одну клетку Candida albican в течение шести часов.

Среднее количество Candida albicans, поглощенных на один макрофаг, составляло 3,4, но интересно, что макрофаги могли поглощать до 16 клеток гриба. Полученные данные позволяют наблюдать за макрофагами и candida albicans до и во время распознавания и поглощения. Candida albicans hyer может продолжать расти внутри макрофага, что может привести к лизису макрофагов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить эксперименты по видеомикроскопии живых клеток с использованием Candida albicans на клеточной линии J 7 7 4 0,1 микрофагов. Вы должны иметь возможность в одночасье создавать культуры обоих типов клеток и проводить анализ фагоцитоза, который позволит проводить поэтапный анализ распознавания и поглощения миграции, а также созревания фагосом.