Гигантские липосом для работы с изображениями и патч-зажим электрофизиологии

Общей целью этой процедуры является получение гигантских однослойных везикул способом, совместимым с функциональной целостностью мембранных белков, включенных в мембрану везикулы. Это достигается путем нанесения липидов или небольших липосом на проводящую поверхность, такую как предметное стекло с покрытием ITO. Второй шаг заключается в контролируемом испарении растворителя для получения однородной липидной пленки на проводящей поверхности.

Далее тщательно регидратируйте липидную пленку в подходящем буфере и подготовьте камеру электроформирования. Последним шагом является подача колебательного напряжения на липидную пленку для создания гигантских везикул Миллера. В конечном счете, везикулы будут визуализированы, чтобы определить их размер и качество, а также сравнить с везикулами, сформированными с помощью классической техники.

Визуальная демонстрация этого протокола полезна, потому что отложение липидов может быть сложным для освоения, зависит от многих переменных и лучше всего поддается визуальному осмотру. Перед началом этой процедуры извлеките липиды из хранилища при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия и подогрейте до комнатной температуры. Если возможно, проводите эксперимент в атмосфере инертного газа, например, в бардачке.

Затем покройте липиды сухим аргонном или газообразным азотом и на всех этапах сведите к минимуму воздействие воздуха. Если липиды не поставляются в органическом растворителе, суспендируйте 0,3 миллиграмма липидов в хлороформе или циклограмме из расчета 10 миллиграммов на миллилитр. Обратите внимание, что концентрации, указанные производителями, обычно являются только номинальными.

Используйте этанол для очистки стекол с обеих сторон размером 2 25 миллиметров на 37,5 миллиметров с покрытием ITO. Затем добавьте еще 0,1 процента техасского красного DPPE к липидам для флуоресцентной визуализации. Измерьте поверхностное сопротивление с помощью мультиметра, чтобы убедиться, что сторона стекла с покрытием ITO обращена вверх, что обозначается сопротивлением в несколько сотен Ом.

Аспирируйте липиды в шприц, устойчивый к растворителям, при этом игла шприца не полностью касается поверхности ITO. Медленно нанесите липид, перемещая иглу вперед и назад по предметному стеклу. Равномерно покройте поверхность, ища радужный блеск на стеклянной поверхности.

После этого место быстро скользит в вакуумную адгессионную сушку и нагнетает камеру до вакуума менее одного тора в течение 0,5-1 часов. Для удаления следов растворителя. Выпустите вакуум с помощью инертного газа.

Нанесите тонкий слой силиконовой смазки на обе стороны силиконовой прокладки, а затем поместите прокладку на предметное стекло. Оставьте открытым предметное стекло не менее пяти миллиметров на одном конце предметного стекла. Затем тщательно увлажните каждую лунку, поместив иглу шприца 27 калибра на край прокладки, и медленно нанесите буфер, наполнив каждую лунку примерно на 10% тремя миллимолярными кучами.

После того, как липиды увлажнятся, быстро выполните оставшиеся шаги. Поскольку липидные пленки начинают расслаиваться, немедленно проверьте проводящую сторону предметного стекла с помощью мультиметра. Затем нанесите вторую проводящую поверхность ITO slide на верхнюю часть прокладки.

Убедитесь, что выступ должен быть не менее пяти миллиметров за пределами области прокладки и напротив первого выступа, и осторожно нажмите, чтобы обеспечить хорошее уплотнение. Очистите два выступа с помощью этанола. Теперь закрепите сэндвич слайда ITO на электрических контактах, таких как медные стержни или пенопласт с прокладкой.

На этом рисунке показан разнесенный вид камеры и контактного узла в качестве эталона. Подробные планы можно найти в текстовом протоколе с помощью мультиметра. Убедитесь, что между контактами нет короткого замыкания и что контакты правильно подключаются к поверхностям ITO.

Затем поместите камеру электроформования в духовку и нагрейте камеру на 10 градусов Цельсия выше самой высокой температуры плавления среди всех присутствующих липидов. Измерьте зазор между двумя поверхностями с покрытием ITO, чтобы определить амплитуду синусоидальной волны. Амплитуда синусоиды должна составлять примерно 0,7 вольта RMS Для каждого миллиметрового зазора между поверхностями ITO подайте синусоиду с частотой 10 герц в течение 60-90 минут.

Подключите генератор к камере электрообразования и подтвердите напряжение мультиметром. После 60-90 минут электрообразования должны образоваться гигантские унальные пузырьки. Используйте перевернутый микроскоп, оснащенный фильтрующим кубом для техасского красного красителя, чтобы получить изображение липосом.

Липосома должна быть сферической, преимущественно Ella на глаз и без дефектов, таких как нити, свисающие с липосомы. Предыдущие шаги охватывали классическое получение гигантских липосом из чистых липидов. Показано более сложное приготовление с использованием небольших липосом.

Затем сначала приготовьте насыщенный раствор карбоната калия с относительной влажностью 44% при температуре 20 градусов Цельсия. Используйте пластиковый контейнер для йогурта и мюсли с вложенной верхней чашкой, которая была модифицирована с отверстиями в верхней чашке. Поместите насыщенный солевой раствор и излишки соли в плотно закрывающуюся емкость с внутренней полкой.

Замените полку после наполнения и убедитесь, что жидкость находится на 5-10 миллиметров ниже полки. Поместите датчик влажности в выемку сбоку контейнера. Очистите стекла с обеих сторон от стекла с покрытием ITO этанолом.

С помощью мультиметра определите, какая сторона является проводящей, и пометьте непроводящую сторону именем образца. Затем слегка смажьте обе стороны силиконовой прокладки с одним или несколькими удержаниями. Поместите проводящую конструкцию предметного стекла на скамейку и приложите силиконовые прокладки к каждому предметному стеколу, на который будут наноситься липиды.

Убедитесь, что на одном конце есть не менее пяти миллиметров открытого предметного стекла для подключения к электроформировательному аппарату. Разгладьте прокладку, чтобы обеспечить хорошую герметизацию, разбавьте препарат везикулы в изо-модическом буфере с низким содержанием соли примерно до одного-двух миллиграммов на миллилитр. Нанесите липид на предметное стекло в количестве от одного до 10 микролитров капель.

Поместите предметное стекло на внутреннюю полку над насыщенным раствором соли и плотно закройте контейнер. Оставьте при комнатной температуре на три часа до ночи. Теперь предметное стекло может быть использовано для электрообразования гигантских липосом, как было показано ранее в классическом протоколе.

Обратите внимание на радужный вид отдельных отложений. На этом изображении показаны липосомы, электрообразованные из липидов, отложенных из хлороформа, стрелки указывают на гигантские липосомы. На этом изображении очень мало нечетких участков и, таким образом, это указывает на хорошую подготовку.

На следующем изображении много нечетких областей, что указывает на плохую подготовку. Обратите внимание, что вторая стрелка указывает на область с плохо различимыми липосомами и что никакие липосомы не могут быть сфокусированы в области, указанной третьей стрелкой. Здесь показано 10-кратное увеличение липосом, успешно электрообразованных из липидов, отложенных в результате дегидратации малых липосом.

Стрелки указывают на три липосомы хорошего качества размером примерно от пяти до 20 микрометров при 40-кратном увеличении. На краю липосомы можно увидеть четкое кольцо, которое указывает на однолунную или почти люмальную липосому. Активированные капсаицином ионные токи TR PV one, зарегистрированные в участках липидной мембраны, вырезанных из образовавшихся гигантских липосом, изображены здесь.

Ток утечки показал сопротивление уплотнению 500 мега до добавления капсаицина. Насыщающий капсаицин активировал большой T RRP V один ток. Текущее возвращение к исходному уровню, так как капсаицин вымывается из пластыря во время попытки этой процедуры.

Важно оставаться гибким, так как многие факторы влияют на то, как липиды обезвоживаются и образуют ровную пленку на стеклянной подложке. Обратитесь к нашему онлайн-разделу по устранению неполадок и измените температуру, влажность, концентрацию липидов и размер капель для достижения наилучших результатов.