Свет Анализ предпочтений по изучению врожденных и суточного Регулируемые Photobehavior в

Общая цель следующего эксперимента заключается в проверке врожденного и циркадного фотоповедения личинок drosophila с помощью теста на предпочтение света и темноты. Для этого сначала экспериментальные личинки выращиваются в определенных условиях освещения и темноты для установления в них исходных циркадных ритмов. Затем личинок переводят в условия постоянной темноты, что позволяет циркадным часам личинок функционировать в свободном режиме.

Когда личинки достигают третьей стадии кормления (L3), их распределяют по группам для тестирования световых предпочтений в разные моменты циркадного цикла. Полученные результаты демонстрируют врожденные и циркадные световые предпочтения, которые определяются путем расчета индекса предпочтения и сравнения данных между временными точками и экспериментальными группами. Хотя данный метод позволяет получить представление о врожденной и циркадной регуляции светового восприятия и механизмах фототаксиса, он также может быть применен к другим системам, таким как обоняние, хемотаксис и термотаксис.

Аналогичным образом, данный метод может быть модифицирован для тестов на обучение и память. Процедуру продемонстрируют Алина и BMA аспирантам из моей лаборатории. Для сбора яиц позвольте взрослым мухам в период спаривания откладывать яйца в течение 12 часов на свежий субстрат, после чего перенесите их в новые флаконы. Продолжайте переносить взрослых особей каждые 12 часов при цикле 12 часов света и 12 часов темноты.

Держите собранные за 12 часов яйца в инкубаторе. Для эксперимента доведите животных до стадии ранней L3 личинки. Это стадия кормления, которая наступает через 84–108 часов после откладки яиц.

Правильная стадия подготовки LAE имеет решающее значение для успеха эксперимента. Начиная с поздней третьей стадии, LAE меняет фотоповедение. Для тестирования циркадных компонентов зрительного поведения за 48 часов до исследования и непосредственно перед субъективным рассветом личинок поместите собранных личинок в картонную коробку.

Затем перенесите контейнер в инкубатор с постоянной темнотой на 48 часов; до завершения эксперимента эти личинки не должны подвергаться никакому воздействию в отведенном им пространстве. Подготовьте крышку чашки Петри диаметром 9 см, используя квадрат со стороной 20 см, разделенный на четыре квадранта в качестве направляющей.

Приклейте квадраты из алюминиевой фольги размером 10 сантиметров в противоположных квадрантах и закройте их черной изолентой. Обязательно закройте край крышки. Затем приклейте квадрат размером 20 сантиметров, разделенный на четыре квадранта, на стол под источником света.

Отметьте на листе контур контрольной чашки, чтобы использовать его в качестве ориентира для обеспечения единообразного смещения. Установите светодиодную лампу над чашкой Петри с помощью штатива. Отрегулируйте высоту таким образом, чтобы вся тестовая пластина освещалась равномерно.

Отрегулируйте интенсивность освещения на тестовом участке до значений от 350 до 760 luxe, изменив высоту лампы или используя регулируемый источник питания. В помещении для проведения эксперимента должно быть красное освещение и температура, соответствующая температуре в месте содержания животных. Пробирки выдерживали в течение двух дней в условиях постоянной темноты.

Соберите лаву из корма с помощью шпателя с верхних пяти миллиметров слоя корма. Распределите корм по внешней стороне крышки чашки Петри. Добавьте в корм немного воды и осторожно перемешайте его шпателем.

С помощью кисти нанесите каплю водопроводной воды в новую чашку. Перенесите личинок в каплю воды для их промывки. Затем с помощью влажной кисти соберите личинок.

Отберите только личинок третьей стадии (L3) в фазе раннего кормления, избегая личинок L3 в фазе позднего перемещения. Перенесите отобранных личинок в центр тестовой чашки. Личинки L3 в фазе кормления имеют открытые передние сферические структуры, выступающие наружу.

В форме пальца. Задние сферические структуры имеют по три отверстия каждая и четыре группы крупных разветвленных волосков. Слюнные железы простираются до второго сегмента брюшка.

После того как 30 личинок будут помещены в центр тестовой пластины, накройте ее подготовленной крышкой. Включите светодиодную лампу. Запустите таймер и дайте личинкам свободно перемещаться по пластине в течение пяти минут.

Затем быстро снимите крышку и подсчитайте количество личинок в темном и светлом квадрантах. Маркировка положения каждой личинки может облегчить подсчет. Также может помочь быстрое фотографирование; личинки, проявляющие неочевидное предпочтение к свету, например, ползающие по стенкам или зарывающиеся в агар, должны быть засчитаны как нейтральные и добавлены к общему числу личинок при расчете индекса светового предпочтения.

После подсчета личинок утилизируйте планшет и используйте новый тестовый планшет для следующего эксперимента. После проведения от 10 до 15 испытаний для каждого генотипа приступайте к анализу в соответствии с протоколом. Предпочтение света и темноты личинок Canton ES сравнивали в два разных циркадных периода.

Личинок, находившихся в фазах CT 0 и CT 12 (субъективно — рассвет и закат), выдерживали в течение 48 часов в стандартных условиях, после чего переводили в условия постоянной темноты на три дня. Тестирование реакции на свет и темноту при освещенности 350 люкс показало, что светочувствительность личинок, протестированных в фазе CT 0, была выше по сравнению с личинками в фазе CT 12. Согласно данной формуле, предпочтение темноты у личинок CT 0 составило 0,52 по сравнению с 0,36 у личинок CT 12.

Сравнение индексов для личинок CT 12 с помощью теста Уилкоксона дает значимое значение P, равное 0,023. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как тестировать световые предпочтения личинок трофофазы при различных схемах и временных точках для достижения этой цели. Вы должны уметь проводить синхронизацию личинок стадии F3, тестировать их фотофобное поведение и рассчитывать индекс светового предпочтения для статистического сравнения.