Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции

Общая цель следующего эксперимента заключается в визуализации миграции дендритных клеток в дренирующий лимфатический узел с помощью неинвазивной фторной магнитно-резонансной томографии (МРТ) в сочетании с традиционной протонной МРТ. Это достигается путем предварительного получения дендритных клеток из костного мозга мыши и маркировки полностью дифференцированных клеток частицами, обогащенными фтором. На втором этапе клетки, маркированные фтором, вводятся внутрикожно в задние конечности мыши для обеспечения эффективной трансмиграции введенных клеток.

Затем проводится МРТ исследуемой анатомической области с использованием ядер фтора и протонов для мониторинга миграции дендритных клеток из кожи в дренирующие лимфатические узлы. В конечном итоге миграция дендритных клеток из места введения в дренирующий лимфатический узел может быть визуализирована с помощью МРТ на фторе. Основным преимуществом этого метода перед другими методами отслеживания клеток, например, требующими использования наночастиц оксида железа, является то, что связанный с углеродом фтор практически отсутствует во всех живых организмах.

Это позволяет получить изображения полностью без фона и обеспечить полную селективность клеток после введения клеток, меченных фтором, in vivo. Данный метод может помочь в решении вопросов в области иммунологии, например, какого влияния оказывают молекулярные кандидаты на миграцию дендритных клеток in vivo. Метод демонстрируют техник Юлия Ковски и старший научный сотрудник моей лаборатории Хельма VIIs на 10-й день культивирования дендритных клеток костного мозга.

Активируйте дендритные клетки с помощью LPS в течение 24 часов. В этот же период проведите маркировку дендритных клеток частицами перфтор-15-краун-5-эфира с высоким содержанием фтора в концентрации 1 мМ. Чтобы подтвердить успешную маркировку дендритных клеток, проверьте физико-химические характеристики клеток с помощью проточной цитометрии. Маркированные фтором клетки представлены здесь в виде красных событий на графике прямого и бокового светорассеяния, а немаркированные клетки — в виде синих событий.

Далее зафиксируйте мышь линии C 57 black six в держателе, затем наберите в туберкулиновый шприц объемом 0,5 мл с иглой 26,5 G флуоресцентно меченые дендритные клетки в объеме от 50 до 100 µL. Теперь осторожно введите иглу в верхние слои кожи каждой задней конечности животного, чтобы ввести клетки подкожно. После анестезии мыши поместите животное в положение на животе на ложе для мышей МРТ-сканера для мелких животных.

После фиксации животного в держателе для визуализации и подключения к системе мониторинга переместите держатель в центр РЧ-катушки для протонов фтора, чтобы подтвердить правильность позиционирования животного относительно сканера. Это также потребуется для последующего планирования геометрии срезов изображения. С помощью программного обеспечения МР-сканера получите скаут-изображения в трех стандартных проекциях, используя методы быстрого получения изображений с низким разрешением.

Настройте РЧ-катушку на резонансную частоту протонов и на резонансную частоту фтора. Используйте монитор настройки МР-сканера для животных, чтобы согласовать характеристический импеданс катушки с сопротивлением 50 ohms. Затем установите необходимые автоматические системные параметры, включая шиммирование для точной настройки однородности магнитного поля, регулировку частоты системы для настройки РЧ на конкретную частоту ЛАР МР-системы для протонов и усиление опорного сигнала.

Для регулировки амплитуды РЧ-импульса настройте протокол turbo rare 3D для протонного сканирования, используя TR 1500 мс, TE 53 мс, матрицу 400 × 200 × 200 и фактор rare 16. Отрегулируйте поле обзора с помощью скаут-изображений. Затем запустите сканирование.

Загрузите последовательность одноимпульсного FID с TR не менее 1000 миллисекунд, затем откройте окно редактирования сканирования и в методе редактирования панели инструментов установите в качестве ядра фтор. Снимите выделение с функции автоматического усиления опорного сигнала в настройках (go setup). Запустите измерение без записи данных, чтобы отобразить МР-сигнал в режиме реального времени.

Отрегулируйте базовую частоту так, чтобы спектральный пик фтора был центрирован на нуле герц в окне сбора данных. Затем выберите «apply basic frequency» и нажмите «stop now». Скопируйте протокол turbo rare 3D из предыдущего сканирования протонов.

Перейдите в раздел редактирования метода и снимите выделение с пункта автоматического усиления опорного сигнала, как показано в меню редактирования сканирования. Выберите ядро фтора, затем установите размер матрицы 128 × 64 × 64 и коэффициент усреднения не менее 40. По завершении сканирования извлеките держатель для мыши из МРТ-сканера и с помощью меню просмотра наложите изображения фтора на изображения протонов.

После забивания мыши извлеките интересующий подчелюстной лимфатический узел и поместите его в ЯМР-пробирку диаметром 5 мм, содержащую 100 µL 2% PFA. Затем поместите пробирку в катушку для фтор-спектроскопии и переместите катушку в изоцентр магнита. Настройте РЧ-катушку на резонансную частоту фтора, а затем, используя монитор настройки МР-сканера для животных, согласуйте характеристический импеданс катушки до 50 Ом в инструментарии для шиммирования.

Установите все параметры шиммирования на ноль и нажмите «apply». Затем загрузите последовательность одноимпульсного FID с TR не менее 1000 миллисекунд. Откройте меню «edit scan» и выберите фтор в качестве ядра.

Теперь, используя настройки запуска (go setup), запустите последовательность, отрегулируйте базовую частоту так, чтобы спектральный пик фтора находился в центре окна сбора данных при нуле герц, и примените базовую частоту. Затем снова отрегулируйте аттенюатор импульса, чтобы максимизировать сигнал для достижения возбуждения 90 градусов. Когда сигнал достигнет максимума, нажмите стоп.

Наконец, в методе редактирования (edit method) установите количество усреднений в диапазоне от 64 до 256 в зависимости от сигнала, после чего используйте функцию запуска конвейера (go pipeline). Начните сбор данных через 18–21 час после внутрикожного введения. Меченные фтором дендритные клетки мигрируют в дренирующий подколенный лимфатический узел.

Движение дендритных клеток по лимфатическим протокам в дренирующий паховый лимфатический узел можно оценить путем наложения анатомических протонных изображений на изображения фторированных дендритных клеток. На изображениях дендритные клетки представлены в виде сигнала fluorine МР красным цветом, тогда как лимфатические узлы и лимфатические протоки показаны на анатомическом протонном МР-изображении в градациях серого. Для количественной оценки степени миграции дендритных клеток в дренирующие лимфатические узлы выполняется выделение лимфатических узлов и проведение fluorine МРС, как было продемонстрировано ранее; при сравнении сигнала fluorine, полученного от каждого лимфатического узла, с сигналом fluorine, полученным от различного количества дендритных клеток, меченных частицами per fluoro 15 crown 5 ether (как показано на этой калибровочной кривой), для данного репрезентативного эксперимента можно определить число фтор-меченных дендритных клеток, достигших дренирующего лимфатического узла.

Можно оценить, что 7,5 × 10⁴ дендритных клеток, не нагруженных антигеном, достигли левого лимфатического узла, в то время как 3,6 × 10⁵ нагруженных антигеном дендритных клеток достигли правого лимфатического узла. Хотя эти данные могут дать представление о молекулярных механизмах миграции иммунных клеток в нормальных условиях, они также могут быть использованы в моделях животных, например, при аутоиммунных заболеваниях. Кроме того, применение данной методики распространяется на область терапии рака.

Любые выявленные молекулярные мишени могут быть использованы для манипулирования дендритными клетками в целях терапии опухолей.