После вложения Immunogold маркировки синаптические белки в гиппокампе культур Slice

Общей целью данной процедуры является проведение мечения ImmunoGold для определения ультраструктурной локализации синаптических белков в нейронах одного параметалла гиппокампа крысы. Это достигается путем предварительного удаления CA одной области органотипического среза, обрезки верхнего угла, чтобы запомнить правильную ориентацию, и инкубации его в фиксаторе без осмия на льду. Второй шаг заключается в обезвоживании неподвижной ткани и предоставлении ей возможности затвердеть путем инфильтрации ее смолой.

Далее из тканей, погруженных в смолу, вырезаются ультратонкие срезы и помещаются на никелевые решетки. Завершающим этапом является проведение иммуногистохимии на срезе тканей. В конечном счете, иммуноэлектронная микроскопия используется для определения локализации белков в синапсе. Хорошо.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синаптической пластичности, например, как локализация белков в дендритных шипах может помочь понять их роль в синаптической функции. Хотя этот метод оптимизирован для органотипических срезов гиппокампа, он также может быть чрезвычайно ценным для других нейронных препаратов, включая острые срезы мозга и первичные нейронные культуры. Начните эту процедуру с помещения органотипического среза гиппокампа в полистирольную чашку Петри, содержащую свежий холодный фосфатный буфер Соренсена.

Добавьте еще один-два миллилитра ледяного буфера прямо поверх ломтиков. Для того, чтобы изолировать подполе среза CA, используйте одноразовый скальпель, чтобы аккуратно разрезать срез рядом с зубчатой извилиной, которая параллельна одноклеточному слою CA. Затем разрежьте оставшийся ломтик вертикально, чтобы удалить подполе CA three и сулу.

Затем отрежьте угол СА на один срез, чтобы помочь определить верхнюю поверхность ткани, и осторожно удалите ткань с мембраны с помощью тыльной стороны скальпеля. Аккуратно перенесите ткань на 12-луночную пластину, содержащую ледяной буфер Соренсена. Удалите буфер и добавьте 0,5-1 миллилитр ледяного фиксатора при pH 7,3, разведенного в буфере Соренсена, чтобы он адекватно покрывал образец.

Затем выдерживать в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации извлеките фиксатор из лунки и промойте образцы три раза в течение 20 минут в ледяном буфере Соренсена. Затем инкубируйте образец в 1% от массы дубильной кислоты на объем в буфере из 0,1 молярного малата при pH 6,0.

Через 40 минут смойте дубильную кислоту, дважды промыв образец в течение 20 минут в буфере для малата. Далее инкубируют образец в течение 40 минут в 1%-ном ацетате писсуара в малатном буфере ацетата писсуара чувствительно к свету и является радиоактивным. Поэтому обращайтесь с ним осторожно и поместите образец в темноту при температуре четыре градуса Цельсия во время инкубации.

После инкубации промойте образцы дважды по 20 минут каждый в ледяном буфере из малата, затем инкубируйте в течение 20 минут в 0,5% хлориде платины в буфере для заключенных. Наконец, смойте остатки хлорида платины, дважды промыв в течение 20 минут. Каждый заключенный хранит образцы в малатном буфере при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к дальнейшей обработке.

Чтобы начать иммуногистохимию, неподвижные участки CA One сначала встраивают обезвоженную смолу и разрезают для получения 60-нанометровых ультратонких срезов на никелевых сетках, как описано в текстовом протоколе к этому видео. Затем поместите каплю 1%-ного двухфосфатного буфера при pH 7,5 на кусок чистого параформа. Затем аккуратно поднимите сетку чистыми щипцами и поместите ее на буфер секцией вниз, инкубируйте так 10 минут при комнатной температуре после инкубации, слейте лишнюю жидкость из сетки, положив секцию вверх на фильтровальную бумагу.

Кроме того, удалите раствор, застрявший между рукавами электромагнитных щипцов, осторожно протерев полоску фильтровальной бумаги, следя за тем, чтобы срезы не высохли полностью. Затем нанесите каплю 50 миллимолярного глицина на парапленку и поплавайте секцией сетки вниз на растворе глицина при комнатной температуре. Пока образец инкубируется в течение 15 минут, добавьте 2,5%-ную сыворотку животного вторичного антитела в 2,5%-ный раствор БСА и поместите каплю этой смеси на пара-пленку.

После 15-минутной инкубации высушите сетку фильтровальной бумагой и поплавайте на блокирующем растворе в течение 30 минут. При комнатной температуре подготовьте инкубационную камеру, поместив свернутые салфетки Кима вдоль внутренней стороны чистой пластиковой чашки Петри. Положите кусочек чистого парама в центр чашки Петри, а затем добавьте фильтрованную воду в салфетки Кима.

Далее капля первичного раствора антитела помещают на параформу и плавают на ней образец при комнатной температуре или на ночь При четырех градусах Цельсия необходимо экспериментально определить оптимальное время и температуру инкубации, а также концентрацию антител. После инкубации с первичным антителом промойте сетку три раза в течение двух минут каждый с 1%-ным двухфосфатным буфером. Затем инкубируйте со вторичным антителом с использованием от одного до 20 анти-кроличьих или анти-УЗИ в сочетании с 10-нанометровым золотом через один час.

При комнатной температуре промыть три раза по две минуты каждый с 1%-ным 20-процентным фосфатным буфером. Затем поместите образец в буферный 2% глутаральдегид на пять минут. Удалите излишки слюарного альдегида, промыв три раза 1%-ным твином, 20-фосфатным буфером, а затем трижды промывкой фильтрованной водой в течение двух минут каждый раз.

После полоскания выдержите сетку в 2% ацетате писсуара в течение 10 минут. Во время инкубации подготовьте камеру, свободную от CO2, поместив кусочек параформы в центр стеклянной чашки Петри. Затем поместите от 10 до 15 гранул гидроксида натрия в чашку вокруг параформы, чтобы они поглотили CO2 в воздухе.

Держите верх закрытым в течение нескольких минут. Далее с помощью пастбищной пипетки быстро переложите небольшой объем свежеприготовленного раствора цитрата свинца Рейнольдса в параформу. Откройте верхнюю часть ровно настолько, чтобы вставить пастбищную пипетку, чтобы свести к минимуму повторное попадание CO2 в камеру.

В трех маленьких стаканах приготовьте теплую свежеккипяченую деионизированную воду, смойте ацетат писсуара, окунув сетку в первый клюв, и аккуратно покрутите ее вокруг в течение 30 секунд. Повторите этот шаг в двух других мензурках. После промывки откройте верхнюю часть стеклянной чашки Петри ровно настолько, чтобы поместить сетку на каплю раствора цитрата свинца Рейнольдса.

По возможности надевайте при этом маску, чтобы избежать вдыхания цитрата свинца и предотвратить образование осадка. Через 10 минут слегка приоткройте верх и снимите сетку. Промойте его три раза, окунув последовательно в три свежих стакана теплой дистиллированной воды.

Затем дайте сетке высохнуть на листе фильтровальной бумаги сечением вверх. Теперь образец готов к просмотру с помощью электронного микроскопа: ультратонкие срезы тканей примерно одной области гиппокампа, показанные здесь в виде просвечивающей электронной микрофотографии, содержат легко различимые дендриты и шипы параметаллических нейронов. Идентификация асимметричных синапсов между аксональными окончаниями, обозначенными буквой Т, и дендритными шипами, обозначаемыми буквой S, облегчается наличием постсинаптической плотности и четко выраженной плазматической мембраной.

Распределение нейро Грандина в дендритных шипах можно увидеть с помощью мечения ImmunoGold EM и выделено на этих изображениях ПЭМ стрелками. Радиальное расстояние нейрограндина от центра позвоночника до плазматической мембраны позвоночника может быть измерено как нормированное радиальное расстояние. Нулевое расстояние соответствует частице, лежащей на мембране, а значение расстояния, равное единице, представляет частицу в центре позвоночника.

Расстояние от нейрограндина до дендритного отростка может быть показано графически. Здесь его распределение в виде нормализованного радиального расстояния показано синим цветом, а по сравнению со случайным распределением, показанным розовым, этот график показывает, что нейро Грандин расположен близко к плазматической мембране. Этот метод проложил путь исследователям, изучающим нервную систему, к изучению локализации и распределения рецепторов, взаимодействующих с рецепторами белков, транспортеров и ионных каналов, а также многих других в различных тканях мозга, включая кору, таламус, обонятельную луковицу и мозжечок.

Не забывайте, что работа с фиксаторами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторного халата, а также обращение с фиксаторами в пленочном капюшоне.