Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов В естественных условиях

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы быстро активировать или заставить замолчать генетически определенные нейронные популяции в физиологически значимом масштабе времени. Это достигается за счет доставки вирусного вектора, несущего трансгены, которые кодируют нейрон синего света, активирующий канал опсин, или нейрон зеленого света, подавляющий опсин Холла генетически определенным нейронам. В качестве второго шага строится светоизлучающая операционная дорога, состоящая из оптоволокна, прикрепленного к регистрирующему электроду, что позволяет одновременно доставлять свет и вести электрическую запись.

Затем TRO располагается над областью мозга, трансдуцируемой опсином, и опускается в нее. Для того, чтобы вызвать опосредованные опсином и ха-опсином ответы, получены результаты, которые показывают индуцированную светом активацию и ингибирование нейронов, трансдуцированных в канал редсин и ха-халлин, на основе метода записи одного блока, который позволяет регистрировать отдельные нейроны. Этот метод удовлетворяет фундаментальную потребность нейробиологии, позволяя нам точно определить, насколько эффективным может быть свет для управления нейронной активностью с миллисекундным временным разрешением и в конкретных подтипах нейронов, и продемонстрирует это Чин Накамура.

Постдок в моей лаборатории Убедитесь, что при подготовке вируса и работе с ним соблюдаются процедуры первого уровня биобезопасности, а также все местные и правительственные рекомендации, касающиеся животных. Перед стереотаксической инъекцией дайте аликвоте вируса оттаять на льду, а затем кратковременно сбавьте обороты. В настольной центрифуге медленно наполните стеклянный шприц и иглу Гамильтона небольшим количеством силикона или минерального масла.

Убедитесь, что в цилиндре шприца нет видимых пузырьков воздуха. Вставьте шприц в микроинжекторный насос и прикрепите его непосредственно к вертикальному стереотаксическому рычагу. Установив трубку с аликвотой вируса в устойчивое положение, опустите стереотаксический рычаг до тех пор, пока кончик иглы не коснется дна трубки с аликвотой вируса.

Используйте контроллер для микроинжекторного насоса, чтобы удалить нужный объем вируса. После обезболивания крысы кетамином и ксилазином проверьте рефлекторную реакцию на ущипывание пальца ноги, чтобы обеспечить достаточную глубину анестезии с помощью стандартных асептических методов. Поместите животное в стереотаксический аппарат после того, как сделаете разрез по средней линии кожи на верхней части черепа животного небольшими хирургическими ножницами или скальпелем.

Аккуратно отделите соединительную ткань и очистите верхнюю часть черепа с помощью небольшого скребка для костей. Опустите иглу и убедитесь, что координаты Z для bgma и лямбда равны, чтобы установить, что головка находится на одном уровне. Затем переместите стереотаксическую руку в координаты, соответствующие интересующей структуре мозга.

Отметьте предполагаемое место инъекции хирургической ручкой. Используйте ручную дрель, чтобы осторожно протончить череп над целевой областью. Остановитесь, когда сверло достигнет нижней части черепа, и используйте пару очень тонких щипцов, чтобы удалить истонченную кость.

После того, как твердая мозговая оболочка будет обнажена, поместите иглу шприца над целевой областью и опустите иглу до тех пор, пока она не коснется твердой мозговой оболочки. И используйте эту точку для вычисления z. Теперь очень медленно опускайте инъекционную иглу в мозг до тех пор, пока не будет достигнуто правильное Z-положение.

В этом протоколе мишенью является прелимбическая область медиальной префронтальной коры. Вводите вирус со скоростью 0,1 микролитра в минуту. После завершения инъекции подождите 10 минут, прежде чем извлекать иглу, чтобы избежать обратного тока вируса к поверхности мозга.

После использования шовного шва с прикрепленной иглой для герметизации кожи нанесите на рану антибиотики. Сначала прикрепите вольфрамовый электрод от одного до 1,5 мега Ом к стеклянной капиллярной трубке с помощью суперклея. Затем с помощью инструмента для зачистки волокна обнажите оголенный конец многомодового оптического волокна и слегка очистите наконечник волокна этанолом.

Надрежьте кончик волокна клиновидным алмазным ножом и с помощью тонких щипцов аккуратно удалите излишки волокна. Волокно должно легко расщепляться на срезе. Используйте измеритель оптической мощности для измерения интенсивности лазера на кончике оптического волокна.

Для записей in vivo интенсивность света от 20 до 100 милливатт на квадратный миллиметр может надежно вызвать опосредованную каналами активацию или подавление нейронной активности соответственно. Далее вставьте оптическое волокно в капиллярную трубку. Расположите кончик волокна примерно на 500 микрон выше кончика вольфрамового электрода и дважды завяжите тонкую нить шовного материала в нескольких точках рядом с кончиком, чтобы электрод и волокно были прямыми.

Убедитесь, что расстояние между кончиком электрода и ближайшим узлом достаточно для введения в целевую область, как показано здесь. Подготовьте животное к операции, как и раньше. Затем используйте первоначальную трепанацию черепа в качестве ориентира, чтобы сделать новое, чистое, маленькое окно в черепе.

Для позиционирования тро. С помощью тонкой иглы сделайте небольшой надрез на твердой мозговой оболочке. Осторожно опустите ТРО через окно черепа и в мозг в трансдуцируемую область с помощью микромного манипулятора.

Затем продвигайтесь по бездорожью медленно с шагом от 10 до 50 микрон до появления светочувствительной ячейки. Здесь пользовательский интерфейс специального программного обеспечения, написанный в лабораторном режиме, используется для управления однодиодным лазером, а также для визуализации и записи текущей нейронной активности. Записанные сигналы захватываются с помощью полосы пропускания усилителя ex AMP 20 K, отфильтрованной с частотой от 0,3 до восьми килогерц, и аналого-цифровой платы национального инструмента.

Пользовательский интерфейс neuro lux Pro позволяет выбирать аналоговые входы и цифровые выходы. Выберите два аналоговых канала для нейронного и транзисторного транзисторного логического сигнала или сигнала TTL. Установите частоту дискретизации на уровне 20 килогерц, базовый период до светового периода равным двум секундам, а период после светового периода равным двум секундам.

Затем установите длительность импульса лазерной стимуляции TTL, частоту и период стимуляции. Здесь частота составляет 20 герц, а период стимуляции — 500 миллисекунд, что означает, что подается 10 лазерных импульсов с определенной шириной импульса. Пользователь может выбрать либо непрерывную подачу света, либо для повторной записи.

Они могут выбирать интервал между импульсами и количество импульсных штаммов. Данные могут быть получены с записью на диск или без нее После записи. Животное приносится в жертву в соответствии с утвержденными процедурами, а мозговая ткань обрабатывается для проверки размещения эрозии и экспрессии опсина, как показано здесь.

На этом скриншоте программного интерфейса Neuro LX Pro, настроенного на одновременную подачу света и электрофизиологическую запись, показано, как Холл Род Добсон индуцировал подавление спонтанной активности прелимбической параметаллической клетки rap в ответ на 10 секунд непрерывной подачи света с яркостью 532 нанометра. На этой фотографии показано репрезентативное выражение hallo redsin в дорсальном улу. На схеме справа показано место, где была сделана фотография.

Стрелка указывает на положение вольфрамового электрода, а стрелка указывает на положение оптического волокна. На этой фотографии показана репрезентативная экспрессия опсинов канала в прелимбической коре. Опять же, на схеме справа показано место, где была сделана фотография.

Стрелка указывает на положение вольфрамового электрода, а стрелка указывает на положение оптического волокна. Этот пример трассировки, записанной из прелимбической коры головного мозга крыс, показывает канал redsin с двумя триггерными потенциалами действия в ответ на 20 герц, подаваемые синим световым импульсом 473 нанометра в течение 10 миллисекунд каждый, как указано синей полосой. Ниже. Растровый график показывает индуцированные каналом редсин спайки в шести репрезентативных нейронах.

Каждая единица активности отображается в виде точки. Этот пример показывает индуцированное опсином Холла подавление спонтанной активности при непрерывном зеленом освещении 532 нанометра в течение 10 секунд, как показано зеленой полосой в той же области мозга. Растровый график показывает индуцированное дозином Галлера молчание в шести репрезентативных нейронах.

Каждая единица активности отображается в виде точки. На этом изображении показано повторяющееся 20-герцовое управление опсином, вызванное опсином, на крысином предварительно лимпический параметаллический нейрон in vivo Слева отображаются следы напряжения света, вызванного, спайка, полученного в моменты времени 0, 30, 60, 90 и через 120 минут после начала записи. С правой стороны растровый график показывает все 61 повторение световой активации.

Каждая единица активности отображается в виде точки. Здесь in vivo вверху показаны электрофизиологические записи от Haller Dossin, трансдуцированного дорсальным сисмом крысы. Пример трассировки показывает, что 10-секундное непрерывное освещение с яркостью 532 нм, обозначаемое зеленой полосой дорсального субма, выражающего Холла-Добсона, устраняет спонтанную активность.

Ниже приведены средние формы волн двух записанных единиц из приведенной выше кривой. Амплитудный порог использовался для идентификации двух различных нейронов. Наконец, растровый график показывает пять повторений дозсина Галлера, индуцированного сайленсингом этих единиц.

Каждая единица активности отображается в виде точки. Наконец, на этом изображении показаны повторяющиеся 20-герцовые всплески опсина в дорсальном субулярном нейроне крысы in vivo и напряжения вызванных световых всплесков, полученных в моменты времени 0, 30, 60, 90 и 120 минут. После того, как начало записей показано слева, на врезке ниже показана типичная взрывная активность этой ячейки.

Растровый график справа показывает все 61 повторение световой активации. Каждая единица активности отображается в виде точки. Этот метод важен, потому что он демонстрирует, что определенные нейронные подтипы могут быть активированы или заглушены в течение длительных периодов времени.

На самом деле, мы продемонстрировали, что можем активировать нейроны в течение более двух часов. В конечном счете, цель состоит в том, чтобы применить это к ведущему себя животному у животных, выполняющих задачи на внимание или память, чтобы мы могли активировать определенные цепи и увидеть, как они контролируют различные функции памяти.