Очистка и микроРНК профилирования экзосом полученные из крови и питательных сред

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации и количественном определении микроРНК, присутствующих в экзосомах, полученных из крови или среды для культивирования клеток. Это достигается путем первичной очистки экзосом из крови или среды клеточных культур с помощью дифференциального центрифугирования. Вторым шагом является очистка общей экзоомальной РНК с помощью набора для выделения микроРНК нирваны.

После подтверждения целостности и концентрации очищенной РНК она преобразуется в КДНК с помощью реагентов из набора для реакции обратной транскриптазы Megaplex. Затем выполняется этап предварительного усиления с использованием праймеров предусилителя Megaplex и мастер-микса с упреждающим ударом. Для амплификации микроРНК заключительным этапом является запуск ПЦР-реакции в реальном времени с использованием 2 384 луночных микрофлюидных карт или карт TAC man низкой плотности, содержащих высушенные праймерные зонды TAC MAN.

В конечном счете, эта процедура позволит обнаружить до 758 известных микроРНК. Этот метод измеряет вариации содержания экзоомальных микроРНК, которые зависят от источника и физиологических условий, при которых они секретируются. Последствия количественной оценки этих уникальных сигнатур распространяются на разработку биомаркеров и новых терапевтических вмешательств. Стратегии.

Чтобы начать эту процедуру, переверните пробирку с покрытием ЭДТА, содержащую 10 миллилитров цельной крови, пять раз, чтобы обеспечить смешивание антикоагулянта, и поместите ее вертикально при комнатной температуре от 10 до 60 минут, затем центрифугируйте образец при температуре 2000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы отделить кровь. Через 15 минут извлеките пробирку из центрифуги и соберите плазму в новую пробирку объемом 15 миллилитров. Поместите плазму на лед и разбавьте ее равным объемом PBS.

Затем аккуратно перемешайте образец и поместите его в центрифугу центрифуги при температуре 2000 G и четырех градусах Цельсия на 30 минут. Далее извлеките пробу из центрифуги. Переложите его в новую центрифужную пробирку.

Добавьте один XPBS к 24 миллилитрам и центрифугируйте при температуре 12 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 45 минут. Затем перенесите надосадочную жидкость в ультрацентрифужную пробирку и центрифугируйте при температуре 110 000 G и четырех градусах Цельсия в течение двух часов. Через два часа.

Извлеките образец из ультра и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Снова суспензируйте нёбо в охлажденном PBS и поместите образец обратно в ультрацентрифугу. Вращайте со скоростью 100, 000 раз G и четырьмя градусами Цельсия в течение одного часа после центрифугирования.

Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и восстановите небо в 300 микролитрах буфера для лизиса РНК. В качестве альтернативы проба может быть подвешена в буфере PBS или RIPPA. Для электронной микроскопии и вестерн-блоттинга соответственно подготовьте область для выделения РНК, надев средства индивидуальной защиты, протирая поверхности и пипетки R a's zap и используя стерильные фильтрующие наконечники и пробирки.

Затем определите, необходима ли предварительная амплификация РНК, количественно оценив выделенную РНК с помощью спектрометра для образцов с предампезом более 350 нанограммов. Затем подготовьте CD NA из очищенной РНК с помощью мегаплексных пулов. Праймеры обратной транскриптазы.

Начните с размораживания грунтовок на льду. Группы А и В содержат праймеры для микроРНК на микрофлюидных картах, массивах А и В, в то время как они размораживают, помечают две свободные от РНК пробирки объемом 1,5 мл для обратной транскрипции с помощью праймеров пула А или праймеров группы В и готовят мастер-смесь для каждой отдельно из компонентов, как описано в текстовом протоколе. Будьте осторожны, чтобы праймеры для бассейна А и бассейна В были разделены.

Затем переверните пробирки с мастер-смесью шесть раз и центрифугируйте кратко пипеткой 4,5 микролитра реакционной смеси RT в каждую пробирку микрорампы из восьми пробирок полосками. Затем добавьте в каждую пробирку три микролитра образца РНК, содержащего от одного до 350 нанограммов РНК. Перемешайте образец с помощью наконечника пипетки и закройте пробирки.

Кратковременно раскрутите образцы и инкубируйте их на льду в течение пяти минут. После инкубации загрузите реакционные пробирки в ПЦР-машину и запустите ее в следующих условиях. Когда ПЦР будет завершена, храните CDNA при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение одной недели или продолжайте предварительную амплификацию для образцов с содержанием менее 350 нанограммов.

Или, если интересующая вас расшифровка находится в небольшом количестве, выполните следующие шаги по усилению предусилителя: начните с того, что следуйте за праймерами предусилителя для бассейна А и бассейна В на льду и переверните их для смешивания. Далее закрутите прихватку, упредив мастер-микс, и держите ее на льду. Также затем приготовьте мастер-микс для усиления.

Затем пипетку 2,5 микролитра продукта CD NA в микроусилитель восемь трубчатых полосок, а затем добавьте 22,5 микролитра мастер-смеси для реакции усиления предусилителя. Наконец, инкубируйте трубки на льду в течение пяти минут. Затем загрузите образец в ПЦР-машину и запустите ее при следующих условиях.

После того, как реакция амплификации будет завершена, кратковременно центрифугируйте пробирки, а затем добавьте 75 микролитров 0,1 x tris, EDTA pH 8,0 в каждую пробирку. Затем быстро перемешайте трубки и закрутите их вниз. Продолжайте загружать матрицу микроРНК tach man или храните разведенный продукт до одной недели при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Чтобы подготовить образцы для матрицы микроРНК tac MAN, соедините 450 микролитров универсальной ПЦР-матрицы tac MAN master Mix девять микролитров разбавленного продукта амплификации предусилителя и 441 микролитр воды, не содержащей нуклеаз, в 1,5-миллилитровую пробирку без РНК на льду. Затем перемешайте пробирку, перевернув ее шесть раз, и центрифугируйте образец. Кратковременно диспонируйте по 100 микролитров смеси для ПЦР-реакции в каждый порт карты матрицы микроРНК tac man.

Затем дважды центрифугируйте карту при 1000 G в течение одной минуты, а затем запечатайте карту. Далее загрузите массив в термоамплификатор. Затем запустите образцы с использованием стандартных условий термоциклирования, предоставленных праймерами в руководстве Applied Biosystems для матрицы низкой плотности TAC Man на 384 лунки, чтобы провести анализ мРНК в прикладной системе быстрой ПЦР в реальном времени Biosystem 7, 900 HG.

Во-первых, замените тепловые блоки для работы 96-луночной пластины. На изображении просвечивающего электронного микроскопа, показанном слева, изображены экзосомы, выделенные из крови мышей. С помощью способов, описанных в этом видео.

На изображении справа изображены экзосомы, очищенные из клеточных культур, а затем меченные золотом экзосомы анти-CD-81 обычно имеют диаметр от 30 до 100 нанометров. Относительное обилие нормализованных микроРНК, обнаруженных в экзосомах, выделенных из крови грызунов, крови человека и культуры эндотелиальных клеток аорты человека, показано здесь в виде значений дельта-КТ, нормализованных до U шести РНК эндогенного контроля положительных значений дельта-КТ, указывает на то, что микроРНК менее распространена и отрицательна. Значения дельта-КТ указывают на то, что микроРНК более распространена.

Не все микроРНК присутствуют в каждом типе образцов. Например, всего 1:26 не было обнаружено в экзосомах крови грызунов, а в экзосомах H-A-O-E-C отсутствует всего 200 C. Остальные четыре микроРНК присутствуют во всех трех образцах в разном количестве.

Несмотря на то, что этот протокол ориентирован на характеристику экзоомальных микроРНК, отдельные Mr.NA транскрипты также могут быть количественно определены из экзосом с помощью QPCR по сравнению с Mr.NA из цельной крови. Exo Omal, РНК показала аналогичную экспрессию как TNF Alpha, так и фактора роста эндотелия сосудов A. Сочетание этих методов проложило путь исследователям в области биологии РНК к изучению функции циркулирующих РНК. В опосредовании изменений экспрессии генов и в идентификации молекулярных сигнатур, связанных с экзосомами как в нормальном, так и в болезненном состоянии.