Куриных эмбрионов спинного мозга Slice Культура протокола

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании срезов эмбриона курицы для поддержания нормального развития нейронов, в частности двигательных нейронов спинного мозга. Это достигается путем предварительного препарирования эмбриона курицы для удаления висцеральных органов. На втором этапе подготавливают эмбрион, включенный в агаровый блок, и выполняют его нарезку.

Затем срез эмбриона осторожно извлекают из агарозы. Заключительным этапом является перенос среза эмбриона в культуральную среду, которую инкубируют в течение 24 часов при 37 °C. В конечном итоге для демонстрации наличия и локализации спинальных мотонейронов после периода культивирования используют иммунофлуоресцентную микроскопию тонких срезов эмбрионального фрагмента.

Таким образом, данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области нейробиологии развития. Например, в изучении механизмов и молекул, участвующих в миграции двигательных нейронов спинного мозга. Как правило, люди, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку этапы диссекции в протоколе требуют особой тщательности.

Поместите 10 оплодотворенных яиц длинной стороной горизонтально в инкубатор с принудительной конвекцией при 38 °C до достижения стадии «гамбургера» и 24-й стадии по Гамильтону. Обычно для этого требуется примерно четыре дня инкубации. На второй день инкубации стерилизуйте яичную скорлупу, протерев ее салфеткой, смоченной в 70% Ethanol; затем аккуратно проколите плоский конец скорлупы иглой 21G, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл, и удалите 5 мл альбумина.

Это удаляет эмбрион от скорлупы, чтобы он не был поврежден при ее вскрытии. Верните яйца в инкубатор и инкубируйте их еще два дня. По истечении двух дней используйте затупленные.

Продолжайте. Шаг пять: с помощью пинцета осторожно проколите верхнюю среднюю часть скорлупы и удалите участок скорлупы размером примерно 9 см². Сделайте разрез вокруг эмбриона, аккуратно извлеките его и перенесите в HBSS.

Для диссекции. Все используемые эмбрионы должны соответствовать примерно 24 стадии развития. Эмбрионы с любыми признаками отклонений следует удалить.

Поместите чашку с эмбрионом под диссекционный микроскоп. Используя два пинцета номер пять, удалите амниотическую оболочку, хориональную оболочку, аллантоис и головной конец. Затем проведите эвисцерацию эмбриона для удаления всех внутренних органов, используя микродиссекционные ножницы, чтобы разрезать эмбрион по вентральной срединной линии.

Затем зажмите эмбрион одним пинцетом в области рострального отдела туловища. Захватите ростральную часть кишечника и сердце и осторожно потяните. Теперь сомиты эмбриона должны стать отчетливо видны.

Теперь подрежьте грудную стенку тела с помощью микродисекционных ножниц. Затем разрежьте эмбрион поперек пополам между зачатками верхних и нижних конечностей. Аккуратно извлеките поясничную половину препарированного эмбриона, используя два пинцета, чтобы приподнять его из дисекционного раствора, и перенесите в сухую чашку Петри с помощью одноразовой пастеровской пипетки длиной около пяти сантиметров.

Отрежьте снизу и аспирируйте примерно два миллилитра расплавленного 4% (вес/объем) agarose в PBS. Пипеткой нанесите примерно 0,5 миллилитра agarose поверх эмбриона, а затем втяните фрагмент эмбриона в пипетку. Перенесите эмбрион и agarose в пластиковую форму с отслаивающимся слоем, стараясь не допустить образования пузырьков в agarose.

Осторожно опустите эмбрион на дно агарозного кольца в пластиковой форме грудным отделом вниз и с помощью иглы 25-го калибра убедитесь, что эмбрион расположен прямо. В кольцо также попадет часть развивающейся конечности, поэтому важно, чтобы эмбрионы были ориентированы вертикально; для этого поместите пластиковую форму на лед примерно на две минуты. При застывании агарозы следите за тем, чтобы ориентация эмбриона не изменилась.

Установите систему типа VT 1000 S аналогичным образом, чтобы камера была заполнена HBSS и окружена льдом или холодной водой. С помощью суперклея закрепите блок из агарозы на платформе Vibram, затем обрежьте блок лезвием, чтобы вокруг фрагмента с эмбрионом оставался слой агарозы толщиной от 1 до 3 mm.

Включите вибратом и начните нарезку эмбриона. Срезы, содержащие участки почек конечностей с четко выраженным апикальным эктодермальным гребнем, отбирают и переносят в чашку с HBSS. Как правило, на один эмбрион приходится всего один или два подходящих среза.

Осторожно удалите агарозу вокруг срезов ткани с помощью двух игл. Крайне важно выполнить эту процедуру тщательно и аккуратно. Добавьте по 500 µL культурального раствора в необходимое количество лунок 24-луночного планшета для культивирования тканей со сверхнизкой адгезией.

Осторожно перенесите срезы из раствора HBSS в лунки, помещая по два или три среза в каждую лунку, затем поместите 24-луночный планшет в инкубатор для культур тканей при 37 °C с 5% carbon dioxide на 24 часа. По истечении периода культивирования добавьте по 500 µL небуферизованного фиксатора в каждую лунку со срезами эмбрионов и выдержите на льду в течение 20 минут. Затем осторожно аспирируйте весь раствор и трижды промойте в PBS с интервалами по пять минут. После этого добавьте в лунки 30% sucrose в PBS и поместите планшет при 4 °C примерно на шесть часов или дольше, пока срезы не осядут на дно.

После того как срезы погрузятся, перенесите их в чистую чашку Петри диаметром 10 сантиметров и удалите излишки раствора сахарозы с помощью фильтровальной бумаги. Затем добавьте один миллилитр OCT и дайте срезам уравновеситься в течение пяти минут при 20 °C. Плотно зафиксируйте каждый срез в форме, заполненной OCT, после чего снимите пластиковую пленку с формы.

Поместите формы вертикально на сухой лед, чтобы зафиксировать блоки OCT, затем установите их в криостат и выдержите при температуре -24 °C в течение примерно 20 минут для уравновешивания. Затем нарежьте каждый блок на срезы толщиной 15 мкм и нанесите их на стекла SuperFrost Plus. Слайды можно хранить при температуре -80 °C до момента проведения иммунофлуоресцентного окрашивания, как описано в текстовой части протокола; на данном изображении показано состояние развития латерального моторного столба на 24-й стадии по Гамбургеру и Хэмилтону.

Боковое разделение латерального моторного столба визуализировано с помощью окрашивания на LH X one на левой панели. Латеральный моторный столб визуализирован путем окрашивания на Fox P one на центральной панели, а на правой панели представлено совмещение двух каналов. Средняя линия показана пунктиром, а DV обозначает здесь дорсо-вентральную ось.

Статус латерального отдела латерального моторного столба снова показан окрашиванием на LH X one на левой панели и латеральный моторный столб окрашиванием на Fox P one на средней панели; совмещенное изображение представлено справа. На этих изображениях показано развитие на стадии 27. На данных изображениях представлена экспрессия LH X one слева и экспрессия Fox P one на средней панели в срезах срезовой культуры, выращенной в среде, поддерживающей выживаемость диссоциированных краниальных моторных нейронов.

LHX1 больше не экспрессируется в мотонейронах, хотя экспрессия FoxP1 свидетельствует о выживании некоторых клеток LMC. DV обозначает ориентацию дорсо-вентральной оси спинного мозга, а ML — ориентацию медио-латеральной оси латерального моторного столба спинного мозга. В срезах, культивируемых в среде, содержащей 4% сыворотки цыпленка и 100 ng/mL CNTF, можно наблюдать клетки латерального отдела, окрашенные на LHX1 в вентральном роге (левая панель) и клетки LMC в целом, окрашенные на FoxP1 (центральная панель).

Обратите внимание, что некоторые клетки латерального отдела латерального моторного ядра расположены латерально в вентральном роге, как показано стрелкой на левой панели. На этом изображении представлен статус экспрессии LHX1 и FoxP1 в срезах эмбриона, который содержался OVO во время культивирования срезов эмбриона, показанного ранее. На данной гистограмме представлены результаты количественного определения процента клеток латерального отдела латерального моторного ядра, окрашенных на FoxP1+ и LHX1+, по сравнению с клетками латерального моторного ядра, окрашенными на FoxP1+ и LHX1.

Отрицательные данные представлены для клеток, обнаруженных в культурах срезов при различных условиях по сравнению с контрольными эмбрионами, содержащимися in ovo, которые представляют собой 100%. Данные анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. Три звездочки обозначают уровень значимости менее 0,01. При выполнении данного протокола важно соблюдать осторожность при препарировании эмбриона и удалении аксонов из срезов, так как необходимо сохранить целостность моторных аксонов в почке конечности.