Куриных эмбрионов спинного мозга Slice Культура протокола

Общая цель этой процедуры заключается в культивировании ломтиков куриных эмбрионов для поддержания нормального развития нейронов, в частности спинномозговых моторных нейронов. Это достигается путем предварительного препарирования куриного эмбриона для удаления висцеральных органов. Вторым этапом является подготовка и нарезка эмбриона, заложенного в агарроблок.

Далее срез зародыша аккуратно извлекается из агарро. Заключительным этапом является перенос среза эмбриона в питательную среду, которая инкубируется в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия тонких срезов эмбриона используется для того, чтобы показать наличие и расположение спинномозговых двигательных нейронов после периода культивирования.

Таким образом, этот метод может помочь решить ключевые вопросы в области нейробиологии развития. Например, механизмы и молекулы, участвующие в миграции спинальных двигательных нейронов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что на этапах протокола вскрытия требуется большая осторожность.

Поместите оплодотворенные 10 яиц с самой длинной стороной горизонтально в инкубатор с принудительной тягой при температуре 38 градусов Цельсия до тех пор, пока они не разовьются до гамбургера и стадии Гамильтона 24. Обычно для этого требуется примерно четыре дня инкубации. На второй день инкубации простерилизуйте яичную скорлупу, протерев папиросной бумагой, смоченной в 70% этаноле, осторожно проткните плоский конец скорлупы яйца с помощью иглы 21 калибра, прикрепленной к пятимиллилитровому шприцу, и удалите пять миллилитров альбумина.

При этом эмбрион опускается подальше от скорлупы, чтобы эмбрион не был поврежден при открытии скорлупы. Верните яйца в инкубатор и высиживайте их еще двое суток. По прошествии двух дней используйте тупой.

Делайте больше. Номер пять, щипцами тщательно проткнуть верхнюю середину оболочки и удалить около девяти сантиметровых квадратных метров оболочки. Разрежьте вокруг эмбриона и осторожно вытащите эмбрион и поместите в HBSS.

Для вскрытия. Все используемые эмбрионы должны быть близки к 24 стадии. Любые эмбрионы, которые демонстрируют какие-либо признаки аномалии, должны быть отбракованы.

Поместите чашку с эмбрионом под микроскоп для вскрытия. Используйте два длинных щипца номер пять для удаления амнионной мембраны. Хорио Алана к мембране, Алан Тус и голова затем потрошат эмбрион, чтобы удалить все внутренние органы, используя микроножницы, чтобы открыть вентральную среднюю линию эмбриона.

Затем обведите эмбрион вокруг ростральной области ствола одной парой щипцов. Возьмитесь за ростральную часть кишки и сердце и потяните. Квартальный. Вы должны быть в состоянии четко видеть сомиты эмбриона.

Теперь обрежьте грудную стенку тела с помощью ножниц для микродиссекции. Далее разрежьте зародыш пополам пополам поперек между почками верхней и нижней конечности. Аккуратно удалите поясничную половину рассеченного эмбриона с помощью двух щипцов, чтобы вытащить эмбрион из диссекционного раствора и поместите в сухую чашку Петри с помощью одноразовой пипетки для пасты примерно на пять сантиметров.

Срежьте снизу, отсадите примерно два миллилитра расплавленного 4% веса на объем. Aros в пипетке PBS нанесите примерно 0,5 миллилитра aros поверх эмбриона, а затем засосите частичку эмбриона в пипетку. Перенесите эмбрион и арос в отслаивающуюся пластиковую форму, не вводя пузырьки в арос.

Осторожно опустите эмбрион на дно ароса в пластиковой форме грудным отделом вниз и используйте иглу 25 калибра, чтобы убедиться, что эмбрион прямой. Агрос также будет содержать часть развивающейся конечности, и важно, чтобы эмбрионы располагались вертикально в аросах, чтобы позволить им разместить пластиковую плесень на льду примерно на две минуты. Чтобы установить арос, позаботьтесь о том, чтобы эмбрион не изменил ориентацию в этот период.

Установите подобие VT 1000 S foma аналогично так, чтобы камера была заполнена HBSS и окружена льдом. Холодная вода. Используйте суперклей, чтобы закрепить блок aros на платформе Vibram, а затем обрежьте блок лезвием бритвы, чтобы оставить часть эмбриона с одним-тремя миллиметрами aros вокруг него.

Запустите вибрато и начните нарезать эмбрион. Срезы, которые включают в себя участки почек конечностей с четким апикальным электродермальным гребнем, отбираются и затем переносятся в чашку с HBSS. Как правило, на один эмбрион приходится только один-два подходящих среза.

Аккуратно удалите агарозу вокруг срезов ткани с помощью двух игл. Важно, чтобы это было сделано тщательно и тщательно. Добавьте 500 микролитров питательного раствора в необходимое количество лунок 24-луночной культуры тканей со сверхнизким прикреплением.

Осторожно переложите срезы из раствора HBSS в лунку, поместив по два или три среза в каждую лунку, затем поместите 24-луночный планшет в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на 24 часа после периода культивирования при концентрации 500 микролитров небуферизованной фиксации на каждую лунку с ломтиками эмбрионов и оставьте на льду на 20 минут. Затем тщательно отасуньте весь раствор и трижды промойте в PBS с интервалом в пять минут. Затем добавьте в лунки 30% сахарозы в PBS и поставьте тарелку при температуре четыре градуса Цельсия примерно на шесть часов или дольше, пока ломтики не опустятся.

После того, как ломтики утонут, переместите ломтики в чистую 10-сантиметровую чашку Петри и смочите лишний раствор сахарозы. Затем добавьте один миллилитр ОКТ и дайте ломтикам сбалансироваться в течение пяти минут при температуре 20 градусов Цельсия. Установите каждый ломтик в наполненный OCT слой, после монтажа снимите пластиковую форму.

Поместите формы вертикально на сухой лед, чтобы они затвердели, установите блоки OCT на криостат и уравновесьте блоки при температуре минус 24 градуса Цельсия в течение примерно 20 минут. Затем разрежьте каждый ломтик на участки по 15 микрон и установите на супер инеи плюс слайды. Предметные стекла могут храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся для иммунофлуоресцентного окрашивания, как указано в текстовой части протокола, это изображение показывает состояние генерации бокового моторного столба на стадии 24 Гамбургера и Гамильтона.

Боковое деление боковой колонки двигателя визуализируется с помощью окрашивания LH X one на левой панели. Боковая моторная колонка визуализируется путем окрашивания с помощью Fox P один в центральной панели, а правая панель представляет собой слияние двух каналов. Срединная линия обозначена пунктирной линией, а DV обозначает здесь дорсальную вентральную ось.

Состояние бокового деления боковой моторной колонки снова показано с помощью окрашивания LH X one на левой панели и боковой моторной колонки с помощью окрашивания Fox P one на средней панели с объединенным изображением справа. На этих изображениях показана разработка на стадии 27. На этих изображениях слева показана экспрессия LH X и одна экспрессия Fox P на средней панели в секциях среза, культивируемого в среде, которая поддерживает выживание диссоциированных клеток краниальных моторных нейронов.

LH X one больше не экспрессируется в моторных нейронах, хотя существует некоторая выживаемость клеток LMC, о чем свидетельствует экспрессия Fox P one. DV представляет ориентацию дорсальной вентральной оси спинного мозга, а ML представляет ориентацию медиалатеральной оси латерального моторного столба спинного мозга. Клетки латерального деления, снова окрашенные для LH X one в вентральном роге на левой панели и LMC в целом, окрашенные для Fox P one на центральной панели, могут наблюдаться в срезах, культивируемых в среде, содержащей 4% цыплятной сыворотки и 100 нанограммов CNTF на миллилитр

Обратите внимание, что некоторые клетки латерального деления моторной колонки находятся в боковом положении в вентральном роге, как указано стрелкой на левой панели. На этом изображении показано состояние экспрессии LH X one и Fox P one в срезах эмбриона, содержащегося в OVO, во время культивирования среза эмбриона, показанного ранее. На этой гистограмме представлены результаты количественного определения процента клеток латерального деления моторной колонки, которые окрашивают FOX P один положительный и LHX один положительный по сравнению с клетками латерального моторного столба, которые окрашивают FOX P один положительный и LHX один.

Показаны отрицательные данные для клеток, обнаруженных в культурах срезов в различных условиях по сравнению с контрольными эмбрионами, содержащимися в яйце, которые представляют собой 100% данные, проанализированные с использованием Т-критерия Стьюдента. Тройная звездочка обозначает уровень значимости менее 0,01 при попытке использования этого протокола. Важно соблюдать осторожность при препарировании эмбриона и при удалении агроса из срезов, потому что важно сохранить целостность моторных аксонов в зачатке конечности.