Травма Paradigm по расследованию центральной нервной системы в ремонт Drosophila

Целью этой процедуры является нанесение колющей травмы на вентральный нервный канатик ЦНС личинки дрозофилы и индуцирование клеточного ответа на эту травму. Это достигается путем первой постановки личинок в течение 96 часов после яйцекладки. Затем личиночная ЦНС рассекается и вентральный нервный канатик прокалывается с помощью иглы с тонким языком

Заключительными этапами являются культивирование и последующая фиксация ущемленных вентральных нервных тяжей для иммуноокрашивания или просто культивирование их для покадровой записи. В конечном счете, конфокальная микроскопия образцов может показать динамику прогрессирования раны и изменения в пролиферации, апоптозе и морфологии глиальных клеток. Основное преимущество этого метода по сравнению с 16 методами, такими как травмирование взрослой мухи, заключается в том, что, хотя он все еще является парадигмой для функциональной центральной нервной системы, личиночная ЦНС технически более доступна.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что код бенального нерва может дегенерировать, если этап вскрытия не был начат с обеспечения санитарных условий. Очистите скамью и руки 70% этанолом. Инструменты следует завернуть в салфетку, пропитанную на 70% этанолом, и отложить в сторону.

Когда вы будете готовы взять в руки личинки, разверните ткань и дайте инструментам высохнуть на воздухе. Для этих протоколов жизненно важно, чтобы кончики щипцов идеально соприкасались. Если они их не корректируют, использование камней Арканзаса равноценны.

Загрузите один блок для окрашивания дистиллированной водой и три блока с двумя миллилитрами среды М три ПС. Выберите флакон с лавой 96-часовой давности и добавьте в него немного воды. Затем с помощью шпателя аккуратно достаньте корм с личинками из флакона и разложите его на влажном бумажном полотенце.

Перенесите 10 личинок из разворота в пачку окрашивания водой. Замените воду шесть раз, чтобы полностью очистить лаву. Затем замените воду на М три PS среды.

Перенесите одну из личинок в окрашивающий блок из М трех PS сред и поместите его под препарирующий микроскоп. Удалите VNC с минимальным повреждением тканей. Сначала расположите лаву спинной стороной вверх.

Затем на одной трети расстояния от переднего конца обхватите тыльную сторону двумя парами щипцов. Затем оттяните задний конец щипцами, разрывая эпидермис. Далее разрежьте кишечник там, где он ближе всего к мозгу, потому что там должно содержаться не так много пищи.

Мозг и VNC теперь можно увидеть с заднего края передней половины. Аккуратно удалите жировое тело, кишечник и эпидермис. Обслуживайте периферические нервы с помощью грудного ВНК с помощью двух пар щипцов, расположенных близко друг к другу и раздвигающих их.

Не вытягивайте и не отрывайте диски или периферические нервы из грудного ВНК, иначе это приведет к дегенерации рта. Части также могут быть оставлены прикрепленными к VNC, имагинальные диски должны быть оставлены прикрепленными к мозгу. Теперь более влажная расширилась P 20.

TIP в среду M three PS и используйте ее для переноса VNC в блок окрашивания, содержащий свежую среду M three PS перед повреждением vnc. Убедитесь, что вас собрали достаточно. От четырех до пяти необходимы для замедленного действия, но более 24 необходимы для иммуноокрашивания.

Перенесите одну VNC в чистый окрашивающий блок, содержащий M three PS, под препарирующим микроскопом, поместите дорсальную нейротаблетку в поле зрения. Это наиболее естественная ориентация для VNC с прикрепленными оптическими лепестками. Теперь только один раз используйте фрезовую иглу, чтобы вручную проколоть VNC со спинной стороны практически под прямым углом Цельтесь в брюшную половину VNC.

Укол будет мягко ударять по стеклянной поверхности ниже ткани. Поэтому важно регулярно проверять, достаточно ли острый кончик иглы для следующего попытки. Если он затупился, заточите кончик.

Использование арканзасского камня или аналогичного вентиляционного отверстия для колющих ранений, защита нервов иглой для окрашивания танго является наиболее важным шагом в этой процедуре, поскольку это парадигма травмы. Если игла слишком тупая, рана будет слишком большой, и отверстие, которое может вызвать нервная защита. При нанесении колющих ударов не допускайте соприкосновения стержня иглодержателя со средой после завершения, рана не будет видна даже после флуоресцентного иммуноокрашивания.

Никаких признаков дегенерации не может наблюдаться в фиксированном здоровом ВНК после 22 часов посева. Эта процедура может привести к клеточной дегенерации в VNC, не связанной с нанесением ножа, через 22 часа после нанесения ножа. Ищите шероховатые поверхности, особенно в латеральной вентральной области грудной клетки, на которую указывают наконечники стрел.

В крайнем случае, ВНК выступает наружу. Также ищите отверстия или вакуоли в грудной нейротаблетке, которые могут быть видны как отверстия после флуоресцентного иммуноокрашивания. Обратите внимание на отверстия на наконечнике стрелки.

Образцы с любым из этих признаков дегенерации в нейротаблетках должны быть отбракованы. Чтобы визуализировать аксональную нейротаблетку в живом VNC, используйте белковую ловушку GFP под названием G nine, которая помечает все аксоны. Чтобы визуализировать все глиальные клетки, кроме средней линии gl, используйте репо глиального драйвера G четыре, например, красный репортер U-A-S-D-S S 1 97 Y, несущий обоих репортеров, будет иметь зеленые аксоны и красный GL, которые могут быть зарегистрированы в живых тканях в замедленном режиме.

После прокалывания VNC животных, несущих необходимые репортеры, перенесите заколотый VNC в стеклянную миску с покрытием полиоллизином 3,5 миллиметрового стекла с одним миллилитром M трех PS сред Расположите спинной стороной VNC вниз, затем осторожно прижмите VNC к чашке плоской стороной щипцов, чтобы она прилипла там. Теперь осторожно добавьте один миллилитр M три PS с 15% FPS в камеру визуализации, контролируемую при температуре 25 градусов Цельсия. Получение изображений VNC с помощью конфокальной микроскопии на несколько ограниченном LIR SP two.

Используйте объектив с 20-кратным увеличением и четырехкратным зумом. Установите режим сканирования на XYZT. Установите разрешение в пикселях на 512 квадратов.

Установите для шага Z значение один микрон и собирайте изображения с интервалом в один или два часа. Эти настройки позволят сканировать от восьми до девяти временных точек на других конфокальных микроскопах. Отрегулируйте настройки, чтобы получать подборки изображений на более длительное время.

Баллы до 24 часов. Поражение VNC визуализировалось в виде GFP-отрицательной области внутри нейротаблетки образцов, несущих аксональный маркер G-девяти, вскоре после того, как начали появляться небольшие GFP-негативные области, которые выглядели как отверстия или вакуоли. Такие негативные зоны GFP обычно увеличиваются в течение шести-восьми часов после нанесения ножевого ранения.

Впоследствии негативные зоны GFP уменьшились еще больше, а некоторые даже исчезли через 22 часа после нанесения ножевых ранений. Площадь, занимаемая раной, как правило, была меньше, чем максимальная площадь, наблюдаемая через шесть-восемь часов после нанесения ножевого ранения. Аналогично, красная отрицательная зона DS в глиальных процессах первоначально увеличивалась.

Однако они уменьшились на 22 часа после нанесения ножевых ранений. Интересно, что часто красные положительные глиальные процессы DS заполняли GFP-отрицательные отверстия в нейротаблетках до их исчезновения. Иммуноокрашивание фиксированных образцов, несущих репо GAL 4 и U-A-S-M-C-D-H-G-F-P для мечения глиальных клеточных мембран анти-GFP, показало, что колющее ранение дорсальной стороны привело к образованию вмятины.

Вентральный колющий удар, по-видимому, воздействует на глиальные клетки, связанные с нейротаблетками и нейротаблетками, сильнее, чем глиальные клетки на поверхности и в коре головного мозга. Глиальные отростки оказались дезорганизованными в нейротаблетках, в то время как в коре головного мозга они все еще находились в оболочке VNC и поддерживали свою сетчатую организацию. Травма привела к образованию GS двух положительных клеточных обломков, на что указывают наконечники стрел

Обломки отличаются от нормальных клеток. Он намного меньше и не связан с телом клетки. Это выявило повреждение глиальных клеток, связанных с нейротаблетками, анти-расщепленных каспаз.

Три положительных апоптоза. Окрашивание наблюдалось как в нейронах, так и в глиальных клетках, показывая, что они подверглись апоптозу после колющей травмы. После освоения этой техники ее можно сделать за один-два часа.

Требуется один час, чтобы препарировать код вентиляционного нерва, проколоть их и настроить для покадровой конфокальной микроскопии, а за два часа можно препарировать, проколоть и настроить для культивирования код вентиляционного нерва, после чего образец может быть зафиксирован в желаемый момент времени.