Лазерная Capture Microdissection обогащенного популяции нейронов или отдельных нейронов для генного анализа выражения после черепно-мозговой травмы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как получить обогащенные популяции нейронов гиппокампа и отдельных нейронов из замороженных участков тканей с помощью микродиссекции лазерного захвата для последующего анализа экспрессии генов. Это достигается путем первой анестезии, крысы в анестезиологической камере. Затем крысу интубируют, проводят механическую вентиляцию легких и помещают в стереотаксический держатель головы, чтобы подготовить крысу к черепно-мозговой травме с перкуссией

Вторым шагом является введение жидкостной перкуссионной черепно-мозговой травмы. Затем корональные отделы мозга вырезаются на криостате и окрашиваются либо флуроадиолом, маркером для дегенеративных нейронов, либо фиолетовым красителем. Заключительным этапом является выполнение микродиссекции лазерного захвата и сбор отдельных нейронов или пулов нейронов.

В конечном счете, общая РНК выделяется из захваченных клеток, анализируется на качество и количественно оценивается с помощью биоанализатора Agilent и используется в последующих приложениях, таких как количественная ПЦР в реальном времени и ориентированная на пути или полногеномный микрочиповый анализ. Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими методами, такими как ручная микродиссекция, заключается в том, что мы можем получить обогащенные популяции нейронов или других типов клеток мозга, таких как глия или иммуномодулирующие клетки, или отдельные нейроны из участков ткани. Это позволяет нам проводить анализ экспрессии генов в различных идентифицированных типах клеток в головном мозге и в других гетерогенных тканях, состоящих из нескольких типов клеток, при этом демонстрация этой процедуры будет пропущена.

Дебби Бун, старший научный сотрудник нашей лаборатории. Сначала извлеките мозговую ткань, полученную у крыс с помощью жидкостной перкуссии, черепно-мозговой травмы или фиктивной травмы, из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов по Цельсию, а затем перенесите на температуру минус 22 градуса по Цельсию. Криостат в течение 10 минут довести мозг до температуры раздела, пока мозг оттаивает.

Протрите криостат с помощью РНК-зап, содержащей этанол, и очистите щетки этанолом. По прошествии 10 минут извлеките мозг из трубки и положите его вентральной стороной вверх на кусок марли на стадии криостата, используйте свежее лезвие бритвы и разрежьте мозг, чтобы удалить заднюю часть мозга. Только ростраль к мозжечку и передняя часть у зрительного нерва.

Заполните криоформу монтажной средой для ОКТ и поместите мозг в форму передней стороной вниз. Дайте мозговой ткани замерзнуть в монтажной среде, пока она не станет белой. Это должно занять примерно 10 минут.

Теперь заморозьте диск образца на мозге с помощью ОКТ. Затем снимите форму. Вставьте диск с прикрепленным мозгом в головку образца и затяните винты.

Вставьте одноразовое низкопрофильное лезвие в держатель ножа и затяните рычаг вниз. Начните срез мозга с 20 микрон, чтобы удалить внешний слой ОКТ. Как только область гиппокампа будет достигнута, установите шкалу микрон на 10.

Соберите корональные последовательные срезы, поставив предметное стекло или плюс стекло. Наденьте на участок ткани. Поместите предметные стекла в штатив для окрашивания без РНК при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет завершено разделение.

Прежде чем приступить к окрашиванию участков, протрите все емкости для окрашивания и градуированные цилиндры эсе и промойте в воде milli Q. Убедитесь, что все растворы были приготовлены с использованием воды, не содержащей РНК, и что краситель гребневого фиалки и фторнефритового пятна предварительно прошел через фильтр размером 0,2 микрона. Используйте срезы мозга Тора при комнатной температуре в течение 30 секунд и зафиксируйте в 75% этаноле в течение одной минуты.

Затем приступают к соответствующему противодействию окрашиванию для ЖКМ либо полос нейронов, либо отдельных нейронов для ЖКМ полос нейронов после фиксации, промывают предметные стекла в свободной воде РНК в течение одной минуты, окрашивают 1%-ным гребнем фиолетовым в течение одной минуты. Промойте в воде, свободной от РНК, три раза в течение одной минуты, обезвоживайте 95% этанолом дважды по 30 секунд каждый. Затем 100% этанол дважды по 30 секунд и ксилол дважды по три минуты каждый.

После окрашивания на воздухе просушите все секции в вытяжном шкафу в течение 15 минут, а затем перейдите к LCM.Здесь. Выполняется НОК. С помощью-ячейки два Е микроскопа с инфракрасным диодным лазером сначала отрегулируют центральный джойстик в вертикальное положение.

Затем поверните и зафиксируйте цель Форекс в нужном положении. Поместите предметное стекло с окрашенными срезами гиппокампа в центр предметного столика микроскопа и вручную отрегулируйте до тех пор, пока область гиппокампа не окажется в поле зрения. Используйте курс и найдите настройки фокусировки.

Чтобы сфокусировать секцию, активируйте вакуумный патрон, нажав кнопку вакуума на контроллере. Затем поверните и зафиксируйте объектив 10 x на месте. Снова сфокусируйтесь с помощью курса и точных настроек.

Загрузите колпачки макро LCM в колпачки кассетного модуля и установите колпачок в положение линии загрузки. Поверните рычаг для установки колпачка и расположите его вокруг колпачка. Затем поднимите кронштейн для установки колпачка, чтобы снять колпачки с кассетного модуля.

Поверните рычаг для установки колпачка над предметным стеклом, а затем опустите его вниз над предметным стеколом, чтобы установить колпачок на предметное стекло. Отрегулируйте тонкую фокусировку и переместите джойстик, чтобы проверить, находятся ли ячейки внутри черного круга на крышке. Все клетки, которые нужно захватить, должны находиться внутри этого черного круга.

Теперь задайте параметры лазера. Сначала нажмите кнопку включения лазера на контроллере. Пятно лазерной цели будет видно розовым цветом.

в поле зрения на мониторе компьютера. Установите размер лазерного пятна на малый, чтобы сфокусировать лазер, и отрегулируйте мощность и продолжительность на 65–75 милливатт в течение одной-двух миллисекунд по мере необходимости для оптимального захвата клеток. Чтобы проверить лазер, используйте джойстик, чтобы переместить лазерное пятно в область, где нет ячеек для захвата.

Запускайте лазер с помощью переключателя. Затем с помощью джойстика переместите лазерное пятно в сторону от расплавленного полимерного пятна и проверьте, есть ли видимое темное кольцо вокруг чистой области, куда был выпущен лазер. Чтобы захватить клетки, используйте джойстик, чтобы переместить лазерное пятно по области клеток, чтобы захватить и запустить лазер.

С помощью переключателя большого пальца перемещайте джойстик во время выстрела лазера, чтобы захватить большую площадь клеток. После выстрела во все интересующие вас ячейки поднимите кронштейн для установки крышки. Захваченные клетки отделятся от участка ткани и прилипнут к колпачку.

Колпачок, оставшаяся ткань и недостающие клетки будут видны в поле зрения. Ячейки на крышке также можно увидеть, поместив крышку на пустую часть предметного стекла. Поднимите кронштейн для установки крышек и поверните его к станции разгрузки крышек.

Опустите колпачок в станцию и поверните кронштейн для установки колпачка обратно в исходное положение. Сдвиньте колпачок с помощью инструмента для вставки вдоль платформы и наденьте на колпачок. Поднимите инструмент с прикрепленным колпачком с платформы.

Слегка прикоснитесь колпачком к клейкой части стикера, чтобы удалить нежелательную ткань. Поместите колпачок в пробирку со свободными РНК объемом 0,5 миллилитра, заполненную 100 микролитрами буфера для лизиса, полученного из набора для водной микроизоляции РН. Сразу же закрутите колпачок на 30 секунд, чтобы он лежал.

Клетки инкубируют образцы при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут и замораживают при температуре минус 80 градусов Цельсия до выделения РНК. Процедура окрашивания ЖКМ одиночных поврежденных нейронов после фиксации аналогична процедуре окрашивания полос нейронов. Тем не менее, время инкубации в некоторых случаях отличается, и срезы, выдержанные фтором в течение четырех минут перед промыванием и обезвоживанием, см. в текстовой части протокола для получения подробной информации после окрашивания.

Снова просушите все секции на воздухе в вытяжном шкафу в течение 15 минут. Прежде чем приступить к использованию LCM для захвата отдельных элементов, захватите крышки HS LCM в конденсатор или кассетный модуль с помощью той же процедуры, что и для конденсатора макроэлемента LCM. Опять же, установите размер лазерного пятна на малый, чтобы сфокусировать лазер, но на этот раз отрегулируйте мощность и продолжительность лазера на 65-75 милливатт на 0,45-0,5 миллисекунды для оптимального захвата отдельных клеток.

Поверните кронштейн для установки колпачка над предметным стеклом и опустите рычаг вниз по направлению к предметному стеклу. Чтобы поместить колпачок на предметное стекло, поверхность колпачка захвата HS находится на возвышении над образцом. Во время ЛКМ с помощью джойстика перемещайте лазер над одиночными флюороположительными клетками.

Все захватываемые клетки должны находиться внутри маленького черного колечка на колпачке для стрельбы лазером с помощью переключателя большого пальца. После того, как все клетки в области черного круга будут активированы с помощью лазерного лифтинга, руки для установки колпачка, захваченные клетки отделятся от тканевого участка и прилипнут к захватному колпачку. Теперь поместите еще одно предметное стекло на предметный столик микроскопа и собирайте флуроположительные клетки, пока колпачок HS не заполнится.

Затем поместите колпачок в пробирку со свободными РНК объемом 0,5 миллилитра, заполненную от 40 до 50 микролитрами лизиса, буфера, вихря и инкубаторов, прежде чем снова заморозить при температуре минус 80 градусов Цельсия. Если не сразу выполняется выделение РНК в соответствии с инструкцией в текстовой части протокола. На следующих изображениях показано лазерное микропрепарирование полос определенных клеточных популяций из мозга крысы, замороженных на 10 микрон корональных срезов мозга крысы.

Были приготовлены в соответствии с этим протоколом и окрашены в фиолетовый цвет гребня и ракетный морилка. На этом изображении показаны параметаллические нейроны от одного до трех подполей гиппокампа крысы. Здесь были захвачены гранулярные клетки в зубчатой извилине гиппокампа.

Наконец, мы показываем полосы нейронов, захваченные из двусторонних ядер надхиазмы, расположенных по обе стороны от третьего желудочка и над зрительной хиазмой. SCN содержит главные циркадные часы, которые контролируют циркадные ритмы по всему телу. На следующих изображениях показана микродиссекция с лазерным захватом отдельных нейронов гиппокампа крысы.

Здесь показаны дегенеративные фторсодержащие положительные нейроны гиппокампа здесь, выжившие флуропомощь отрицательные три нейрона до и после показа LCM, захваченные клетки визуализируются на колпачке LCM. На следующих изображениях показан анализ экспрессии генов общей РНК, выделенной из нейронов, захваченных лазером. На этом изображении показаны количественные данные ПЦР в реальном времени экспрессии генов циркадных часов в СХЯ.

Эта тепловая карта экспрессии генов в умирающих и выживших нейронах гиппокампа показывает профилирование экспрессии генов, связанных с апоптозом, с использованием сфокусированных ПЦР-массивов. Наконец, мы покажем пример тепловой карты, созданной на основе анализа экспрессии генов в одном-трех нейронах от одного до трех нейронов крыс, получивших фиктивную травму ЧМТ или ЧМТ, а также лежачий аденоассоциированный вирус миРНК, предназначенный для подавления экспрессии оксида азота нейрона, синтазы или глутатионпероксидазы. оба эти гена являются генами, индуцированными травмой головного мозга после ее развития. Эти методы проложили путь для ученых во многих областях исследований, включая черепно-мозговую травму и рак, которые используют животные модели этих расстройств для выполнения геномного, протеомного и метаболического профилирования конкретных клеточных популяций.

Например, в настоящее время мы используем эти методы для лазерного захвата определенных клеточных популяций из префронтальной коры и прилежащего ядра мозга, которые, как известно, участвуют в зависимости.