Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в создании адгезивных и растворимых градиентов для изучения миграции клеток. Это достигается путем первичной пассивации, поверхности для предотвращения неспецифической клеточной адгезии. Второй шаг – изготовление штампов методом микроконтактной печати.

Затем на обработанную поверхность наносится рисунок стрептококковыми линиями с помощью микроконтактной печати. Пристегнутый дин также может быть напечатан в виде точек с помощью литографии с помощью погружного пера, прикрепленного к нижней части микрофлюидного устройства. Модифицированная поверхность будет выступать в качестве основы для адгезионного градиента биотина RGD.

Заключительным этапом является загрузка элементов на поверхность с помощью адгезивного сигнала в присутствии растворимого градиента химиоаттрактанта. В конечном счете, микроскопия живых клеток используется для отображения миграции клеток в ответ как на адгезивые, так и на растворимые сигналы. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как трансвелловый или пустотный анализ камеры и традиционная микрофлюидная установка, заключается в том, что дезинтегрированная система поверхностного рисунка микрофлюидного устройства позволяет наблюдать за реакцией клеток на пространственно контролируемые адгезивные сигналы и адгезивный градиент и растворимый градиент одновременно.

Что ж, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области миграции клеток, такие как важность клеточной адгезии и вызвать инсульт между рецепторами химиотерапии Техаса, такими как рецепторы наблюдаемой киназы G-белка, сопряженными рецепторами, и рецепторами адгезии, такими как RIN To eat glass cover slips. Сначала очистите чехлы, погрузив их в решетку в 100% этанол и поместив стойку в водяную баню для катания на коньках на 30 минут. Высушите стеклянную крышку на воздухе.

Далее обработать стеклом крышку в течение 30 минут в одном моляре гидроксида натрия. После этого промойте стеклянные поверхности, осторожно опрокинув решетку в стакан, наполненный полутора литрами воды в милликубах. Повторите процесс промывки три раза, каждый раз используя свежую воду в милликубах.

После третьего полоскания просыхает стеклянную крышку в духовке при температуре 60 градусов Цельсия примерно на полчаса. Поместите половину чистого стекла крышки по отдельности во влажную камеру, которая сделана из 24-луночной пластины, частично заполненной водой. Лунки заполняются водой, а поверх лунок укладываются стеклянные покровные стекла для проведения исследования, в котором используется сополимер полилизина и полиэтиленгликоля, в котором 20% молекул PEG привиты к биотину.

Сокращенно PLL Peg биотин капает 15 микролитров биотина PLL Peg в PBS на каждую стеклянную крышку. Возьмите вторую половину оставшейся чистой стеклянной крышки и аккуратно промойте раствор PEG. Оставьте крышки на один час во влажной камере.

После часового скольжения многослойные чехлы аккуратно соскальзывают друг от друга, не соскребая поверхность с полиэтиленовым покрытием, и промывают их водой из полиэтилена. Вода должна легко соскальзывать по обработанной колышком стороне. При необходимости.

Высушите на воздухе стеклянную крышку на бумажном полотенце обработанной поверхностью вверх магазином. Стеклянная крышка скользит в вакуумном высыхающем состоянии до дальнейшего использования. Кремниевый мастер, необходимый для этой процедуры, изготавливается с помощью фотолитографии для нанесения штампа A-P-D-M-S для эластомера PDMS на кремниевый мастер внутри чашки Петри высотой около одного сантиметра и отверждения мастера и смеси PDMS в печи при температуре 70 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем штамп PDMS снимают с силиконового мастера и обрезают по размеру для печати белковых узоров с использованием техники микроконтактной печати, сначала очищают и делают штампы PDMS более гидрофильными путем обработки стороны рисунка в очистителе ультрафиолетового излучения и озона в течение полутора часов сразу после места обработки озоном. И намажьте на штампы PDMS 10 микролитров ободранного адина. Если следы должны быть видны под флуоресцентным микроскопом, используйте полосатый Аден, который сопряжен с флюорочетверкой, например, полосатый авидный и ЛОР три 50.

Оставить на один час во влажной камере. Удалите излишки стрептококка с штампа салфеткой, бумагой и воздухом. Высушите штамп в течение примерно одной минуты.

Слегка прижмите штамп к стеклянной крышке PLL с биотиновым покрытием. Если использовался флуоресцентный стрептококковый дин, изучите картину под эпифлуоресцентным микроскопом. Белковые узоры также могут быть напечатаны с помощью литографии методом погружения.

Сначала смешайте одну часть одного миллиграмма на миллилитр, зачистите шпилькой или зачистите авидан элиф фтор три 50 с 10 частями глицерина и загрузите пять микролитров смеси на консоль. Отрегулируйте скорость печати. Время контакта консоли с поверхностью или вертикальное расстояние консоли до поверхности для уменьшения размера пятна.

Примерно через пять микрометров начинается процесс печати, как описано в руководстве по эксплуатации магазина инструментов для литографии с погружением. Все напечатанные поверхности в состоянии высыхания. Для создания поверхностных градиентов используется коммерчески доступное микрофлюидное устройство.

Приклейте эту стеклянную крышку с тритиновым покрытием или узором на липкую сторону устройства, чтобы гарантировать отсутствие утечки в течение нескольких часов. Заклейте края прибора тонким слоем подогретого вазелина и вторым слоем смеси из одной части вазелина на одну часть парафина. Заполните канал устройства шестью микролитрами PBS, чтобы создать два противоположных градиента.

Заполните два резервуара, один из которых содержит 70 микролитров биотина, четыре флуоресцеина, а другой 70 микролитров биотина, конъюгированного с биотинилированным пептидом, аргинином, глицином, спартиновой кислотой или РГД, инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте в течение одного часа. Промывка биотина, RGD и биотина с помощью микрофлюидного устройства является наиболее сложным аспектом этой процедуры, поскольку существует риск захвата пузырьков воздуха и нарушения микроконтактных печатных дорожек. Чтобы обеспечить успех, биотин и ПБС необходимо удалять осторожно и медленно.

Удалите растворы биотина и дважды тщательно промойте поверхность PBS, все еще находясь на микрофлюидном устройстве. Отметьте направление градиента адгезии перед загрузкой флуоресцентно меченых клеток в микрофлюидное устройство. Посчитайте ячейки и разделите их на две пробирки с равным количеством ячеек.

Промыть и восстановить. Суспензируйте одну пробирку клеток в среде, содержащей химиоаттрактант, такую как DMEM с низким содержанием глюкозы, с 10% промывкой FBS, а другую пробирку клеток в среде. Без химиоаттрактанта, такого как DMEM с 0% FBS, конечная концентрация клеток в каждой пробирке должна составлять пять умножить на 10 пятых клеток на миллилитр.

Извлеките все растворы из микрофлюидного прибора и поместите его на предварительно прогретый микроскоп. Ступенчатая загрузка 70 мкл клеток, ресуспендированных в 0% F-B-S-D-M-E-M в один резервуар. Загрузите 70 микролитров клеток, ресуспендированных в 10% F-B-S-D-M-E-M, в другой резервуар.

Неплотно наклейте ленту на резервуары во избежание испарения. Убедитесь, что канал микрофлюидного устройства находится в поле зрения, а клетки — в фокусе. Выберите параметры получения изображений, такие как время экспозиции и флуоресцентные фильтры.

Последовательность изображений светлого поля и флуоресценции, которые клетки и треки, а также временные точки и длина записи запускают программу получения изображений. В этом видео демонстрируется метод визуализации живых клеток, которые мигрируют в среде с конкурирующими адгезивными и растворимыми градиентами. Клейкие дорожки, содержащие флуоресцентный стриппин и биотинилированный RGD, были созданы с помощью микроконтактной печати или литографии методом погружения.

Об успешной микроконтактной печати свидетельствует линейный профиль интенсивности флуоресценции на дорожках, где можно четко различить клеевые дорожки и противообрастающие области. Точки, напечатанные с помощью литографии погружным пером, выглядят округлыми, а не каплевидными, что указывает на успешный процесс печати. В этом примере точки были напечатаны в линию с расстоянием между строками и столбцами от 10 до 15 микрометров.

Это расстояние достаточно для предотвращения слияния точек друг с другом, но позволяет просматривать несколько точек в одном поле зрения. В большинстве настроек микроскопа с помощью простого устройства микрофлюидики создавался Grady из адгезивных сигналов на напечатанной дорожке. Путем загрузки биотина четыре флуоресцеина и биотина RGD в противоположные стороны микрофлюидной камеры панели.

На выставке представлено 60 мозаичных изображений, сделанных с общей длиной изображения 3072 микрометра. На панели В интенсивность флуоресценции измерялась по всей длине мозаики. Линейные линии тренда были подобраны к интенсивности флуоресценции, чтобы указать градиент RGD в канале.

После удаления биотина, раствора биотина RGD, в той же камере можно вводить растворимый градиент. На панели А показана интенсивность флуоресцентного красителя вблизи резервуаров, заполненных PBS и флуоресцеином, а также поперек канала при Т, равной нулю. На панели B показана интенсивность флуоресценции растворимых сигналов.

После 16-часовой инкубации сравнительные результаты показывают, что градиент оставался стабильным в течение как минимум 16 часов. С помощью этого метода наблюдалась миграция клеток в микрофлюидной камере с противоположными градиентами, и здесь показан репрезентативный фильм. Адгезивный градиент был иммобилизован RGD на стрептококковых дорожках, а растворимый градиент составлял от нуля до 10% FBS.

Снимки делались каждые 15 минут в течение 20 часов. Отображаемый переход изображения составляет восемь кадров в секунду. Этот второй фильм показывает одну гелийную ячейку, мигрирующую к источнику FBS.

Отображаемый переход изображения составляет восемь кадров в секунду. Синяя линия, представляющая траекторию клетки, была получена с помощью программного обеспечения для отслеживания клеток. На последнем рисунке показаны траектории клеток из изображений в первом фильме.

Траектории клеток, которые мигрировали в сторону более высокой концентрации растворимого FPS, показаны черным цветом в эритроцитарных траекториях, которые мигрировали в сторону более высоких концентраций адгезивного RGD. Эти траектории показали, что больше клеток hela мигрировало к источнику химиоаттрактанта, чем к более высоким концентрациям адгезивного RGD. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что во избежание испарения PBS или среды в микрофлюидном устройстве во время подготовки адгезивного градиента и визуализации образа жизни, при необходимости используйте липкую ленту, чтобы закрыть все входные отверстия микрофлюидного устройства.

Другие методы, такие как трансфекция и микроскопия гибридных растворов, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как биомеханика цитоскелета, действующего белком, белки фокальной адгезии и рецепторы во время миграции клеток.