Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Общая цель данной процедуры — создание адгезивных и растворимых градиентов для изучения миграции клеток. Это достигается путем предварительной пассивации поверхности для предотвращения неспецифической адгезии клеток. Вторым этапом является изготовление штампов методом микроконтактной печати.

Затем на подготовленной поверхности с помощью микроконтактной печати создается рисунок из линий стрептавидина. Стрептавидин также может быть нанесен в виде точек методом литографии с помощью дип-пена на нижнюю часть микрофлюидного устройства. Модифицированная поверхность будет служить основой для создания адгезивного градиента биотина RGD.

Заключительный этап заключается в посеве клеток на поверхность с адгезивным сигналом в присутствии градиента растворимого хемоаттрактанта. В конечном итоге для демонстрации миграции клеток в ответ на адгезивные и растворимые сигналы используется микроскопия живых клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как анализ в камерах Трансвелл (Transwell) или камерах с пустотами, а также стандартными микрофлюидными установками, является то, что интегрированная система микрофлюидного устройства с паттернированием поверхности позволяет одновременно наблюдать реакции клеток на пространственно контролируемые адгезивные сигналы, адгезивный градиент и растворимый градиент.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области миграции клеток, такие как значимость клеточной адгезии и перекрестное взаимодействие между хеморецепторами, например, рецепторными тирозинкиназами, G-белоксопряженными рецепторами и адгезивными рецепторами, такими как интегрины. Для подготовки стеклянных покровных стекол сначала очистите их, погрузив в штативе в 100% ethanol, и поместите штатив в ультразвуковую водяную баню на 30 минут. Высушите стеклянные покровные стекла на воздухе.

Затем подвергните стеклянные покровные стекла ультразвуковой обработке в течение 30 минут в 1 M растворе гидроксида натрия. После этого промойте стеклянные поверхности, осторожно наклоняя штатив в стакане, наполненном 1,5 л воды Milli-Q. Повторите процесс промывки трижды, каждый раз используя свежую воду Milli-Q.

После третьего промывания высушите стеклянные покровные стекла в печи при 60 °C в течение примерно получаса. Поместите половину чистых покровных стекол по отдельности в увлажняющую камеру, изготовленную из 24-луночного планшета, частично заполненного водой. Лунки заполняют водой, а покровные стекла укладывают поверх лунок для гидратации. Используется сополимер полилизина и полиэтиленгликоля, в котором 20% молекул ПЭГ конъюгированы с биотином.

Используя сокращенное наименование PLL Peg biotin, нанесите по 15 µL раствора PLL Peg biotin в PBS на каждое предметное стекло. Возьмите оставшуюся половину чистых предметных стекол и аккуратно накройте ими раствор ПЭГ. Оставьте стекла на один час в увлажненной камере.

Через час аккуратно раздвиньте покровные стекла, чтобы они скользнули друг относительно друга, не повреждая поверхность с ПЭГ-покрытием, и промойте их ультрачистой водой. Вода должна легко стекать с обработанной ПЭГ стороны. При необходимости.

Высушите покровные стекла на воздухе, разложив их на бумажном полотенце обработанной поверхностью вверх. Храните покровные стекла в вакуумном эксикаторе до дальнейшего использования. Кремниевая матрица, необходимая для данной процедуры, изготавливается методом фотолитографии для последующего отлива штампа из PDMS; для этого нанесите эластомер PDMS на кремниевую матрицу в чашке Петри слоем примерно один сантиметр в высоту, после чего отвердите смесь матрицы и PDMS в печи при 70 °C в течение одного часа.

Затем штамп из PDMS снимают с кремниевой матрицы и обрезают до нужного размера для печати белковых паттернов методом микроконтактной печати. Сначала штампы из PDMS очищают и делают более гидрофильными, обрабатывая сторону с паттерном в УФ-озоновом очистителе в течение полутора часов. Сразу после озоновой обработки на штампы из PDMS наносят и распределяют 10 µL стриптидина. Если необходимо, чтобы дорожки были видны под флуоресцентным микроскопом, следует использовать стриптидин, конъюгированный с флуорофором, например, стрипт-авидин Alexa Fluor 350.

Оставьте на один час во влажной камере. Удалите излишки strep din со штампа с помощью салфетки, бумаги и обдува воздухом. Просушите штамп примерно одну минуту.

Слегка прижмите штамп к стеклянному покровному стеклу, покрытому биотинилированным PLL. Если использовался флуоресцентный стрептавидин, изучите полученный паттерн с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Белковые паттерны также могут быть нанесены методом литографии с помощью погружного пера.

Сначала смешайте одну часть раствора strippin или stripped avidan elif Fluor 350 в концентрации 1 mg/mL с 10 частями глицерина и нанесите 5 µL смеси на кантилевер. Отрегулируйте скорость печати. Время контакта кантилевера с поверхностью или вертикальное расстояние от кантилевера до поверхности подбирают для уменьшения размера пятна.

Процесс печати начинается с нанесения слоя толщиной примерно 5 µm, как описано в руководстве по эксплуатации прибора для литографии с помощью зонда-перо. Все напечатанные поверхности хранят в эксикаторе. Для создания градиентов на поверхности используется коммерчески доступное микрофлюидное устройство.

Приклейте эти покровные стекла с тритоновым покрытием или рисунком к липкой стороне устройства, чтобы исключить утечку в течение нескольких часов. Герметизируйте края устройства тонким слоем подогретого вазелина, а затем вторым слоем смеси вазелина и парафина в соотношении один к одному. Заполните канал устройства 6 µL PBS для создания двух противоположных градиентов.

Заполните два резервуара: один — 70 µL биотина-флуоресцеина, другой — 70 µL биотина, конъюгированного с биотинилированным пептидом arginine glycine spartic acid (RGD); инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте в течение одного часа. Промывка биотина, RGD и биотина в микрофлюидном устройстве является самым сложным этапом данной процедуры, так как существует риск захвата пузырьков воздуха и повреждения микроконтактно-печатных дорожек. Для успешного выполнения данной операции биотин и PBS необходимо удалять осторожно и медленно.

Удалите растворы биотина и осторожно дважды промойте поверхность буфером PBS, пока она все еще закреплена в микрофлюидном устройстве. Отметьте направление адгезивного градиента перед загрузкой флуоресцентно меченных клеток в микрофлюидное устройство. Подсчитайте количество клеток и разделите их на две пробирки с равным числом клеток.

Промойте и ресуспендируйте клетки. Взвесьте клетки из одной пробирки в среде, содержащей хемоаттрактант, например, в DMEM с низким содержанием глюкозы и 10% FBS, а клетки из другой пробирки — в среде без хемоаттрактанта, например, в DMEM с 0% FBS. Конечная концентрация клеток в каждой пробирке должна составлять 5 × 10⁵ клеток на мл.

Удалите все растворы из микрофлюидного устройства и поместите его на предварительно разогретый микроскоп. Загрузите на предметный столик 70 µL клеток, ресуспендированных в 0% FBS-DMEM, в один резервуар. Загрузите 70 µL клеток, ресуспендированных в 10% FBS-DMEM, в другой резервуар.

Слегка зафиксируйте резервуары лентой, чтобы предотвратить испарение. Убедитесь, что канал микрофлюидного устройства находится в поле зрения, а клетки сфокусированы. Выберите параметры получения изображений, такие как время экспозиции и флуоресцентные фильтры.

Последовательность изображений в светлом поле и флуоресценции, при которой определяются клетки и их треки, а также временные точки и длительность записи, запускают программу сбора изображений. В данном видео демонстрируется метод визуализации живых клеток, мигрирующих в среде с конкурирующими адгезивными и растворимыми градиентами. Адгезивные треки, содержащие флуоресцентный стриппин и биотинилированный RGD, были созданы с помощью микроконтактной печати или литографии с помощью dip-pen.

Об успешном микроконтактном печатании свидетельствует профиль интенсивности флуоресценции поперек дорожек, на котором четко различаются адгезивные дорожки и антифоулинговые области. Точки, напечатанные методом литографии с помощью dip-pen, имеют округлую, а не каплевидную форму, что указывает на успешный процесс печати. В данном примере точки были напечатаны в линию с расстоянием между рядами и столбцами от 10 до 15 micrometers.

Такого расстояния достаточно, чтобы предотвратить слияние точек друг с другом, но при этом оно позволяет видеть несколько точек в одном поле зрения. При большинстве настроек микроскопа с помощью простого микрофлюидного устройства был создан градиент адгезивных сигналов на напечатанном треке. Для этого в противоположные стороны панели микрофлюидной камеры загружали биотинилированный флуоресцеин и биотинилированный RGD.

На рисунке A представлены 60 мозаичных изображений, общая длина которых составляет 3072 микрометров. На панели B показано измерение интенсивности флуоресценции по всей длине мозаики. Для отображения градиента RGD в канале были проведены линейные линии тренда по интенсивности флуоресценции.

После удаления раствора биотина RGD с последовательностью RGD ту же камеру можно использовать для создания растворимого градиента. На панели A показана интенсивность флуоресценции флуоресцеинового красителя вблизи резервуаров с PBS и флуоресцеином, а также по всей ширине канала при T, равном нулю. На панели B показана интенсивность флуоресценции растворимых сигнальных молекул.

После 16-часовой инкубации сопоставимые результаты показали, что градиент оставался стабильным в течение как минимум 16 часов. С помощью данного метода наблюдали миграцию клеток в микрофлюидной камере с противоположными градиентами, и репрезентативное видео продемонстрировано здесь. Адгезивный градиент был создан путем иммобилизации RGD на треках из стрептавидина, а растворимый градиент представлял собой концентрацию FBS от 0 до 10%.

Изображения снимались каждые 15 минут в течение 20 часов. Скорость смены кадров в представленном видео составляет восемь кадров в секунду. На втором видео показана миграция одной клетки heli в сторону источника FBS.

Скорость смены кадров на данном изображении составляет восемь кадров в секунду. Синяя линия, представляющая траекторию клетки, была получена с помощью программного обеспечения для трекинга клеток. На последнем графике показаны траектории клеток на основе изображений из первого видео.

Траектории клеток, мигрировавших в сторону более высокой концентрации растворимого FPS, показаны красным цветом, а траектории клеток, мигрировавших к более высоким концентрациям адгезивного RGD, — черным. Данные траектории продемонстрировали, что большее количество клеток HeLa мигрировало к источнику хемоаттрактанта, чем к более высоким концентрациям адгезивного RGD. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости предотвратить испарение PBS или среды в микрофлюидном устройстве во время подготовки адгезивного градиента и прижизненной визуализации; при необходимости используйте клейкую ленту, чтобы закрыть все входные отверстия микрофлюидного устройства при следовании данной процедуре.

Для ответов на дополнительные вопросы, такие как биомеханика цитоскелета, опосредованная белками, роль белков фокальной адгезии и рецепторов при миграции клеток, могут быть применены другие методы, например, трансфекция и микроскопия с использованием гибридных растворов.