Запись электрической активности нейронов Выявленные в интактном мозге трансгенных рыб

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации электрической активности нейронов в препарате неповрежденного мозга рыбы. Это достигается путем предварительного наркотизирования трансгенной рыбки meca в возрасте от четырех до шести месяцев в MS 2 22 с последующим выделением ее мозга. Затем один из интересующих нейронов, меченных GFP, контактируют с регистрирующим электродом, после чего его электрическая активность записывается методом электрофизиологического патч-клампа в конфигурации loose patch или whole cell.

В конечном итоге результаты могут продемонстрировать изменения частоты генерации потенциалов действия или изменения мембранного потенциала в ответ на различные воздействия в интактном мозге. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как электрофизиология отдельных клеток, культур или препаратов срезов мозга, является возможность характеристики электрических свойств нейронов в препарате целого мозга с сохранными нейронными цепями. Хотя данные измерения позволяют глубже понять репродуктивную нейроэндокринологию, они также могут быть применены к другим нейронным системам, используя таких рыб, как resene fish, например, для изучения нейронов, контролирующих мотивацию и аффективное поведение.

В данной демонстрации используются трансгенные рыбки danio, в которых нейроны GnRH3 генетически помечены GFP. Для начала проведите анестезию взрослой рыбки danio, погрузив ее в 5 мл MS-222. Через несколько минут после прекращения движений жабр перенесите ее в чашку Петри диаметром 60 мм с физиологическим раствором для рыб. Затем с помощью ножниц проведите декапитацию рыбки в каудальном конце оси.

Перенесите голову в чашку Петри диаметром 35 мм, наполовину заполненную физиологическим раствором для рыб и выстланную Sylgard. В чашке должно быть центральное углубление, в котором голову следует расположить спинной стороной вверх и зафиксировать энтомологическими булавками. Осторожно разрежьте дорсальную часть черепа по периметру.

Затем осторожно удалите череп с помощью пинцета, чтобы обнажить дорсальную часть головного мозга, включая переднюю часть спинного мозга. Теперь аккуратно приподнимите спинной мозг тонким пинцетом и перережьте двусторонние соединительные нервы тонкими ножницами. Это включает перерезание черепных нервов, спинномозговых нервов, зрительных нервов с вентральной стороны и передних обонятельных нервов.

Поместите полностью препарированный мозг в новую чашку Петри с новым физиологическим раствором для рыб под микроскопом. Тщательно убедитесь, что весь мозг и гипофиз целы, без разрезов или проколов. Отбракуйте поврежденные образцы мозга и начните процедуру заново, используя иглу.

Нанесите небольшую каплю быстросохнущего клея, например цианоакрилата, в центр регистрирующей камеры. Распределите каплю клея по площади в один квадратный сантиметр. Затем быстро перенесите мозг на клей.

Закрепите его вентральной стороной вверх. Теперь заполните регистрирующую камеру примерно одним миллилитром физиологического раствора для рыб, чтобы покрыть мозг. С помощью тонких пинцетов осторожно удалите мозговые оболочки с поверхности области регистрации мозга, двигаясь вперед.

Осуществляйте непрерывную перфузию мозга аэрированным физиологическим раствором для рыб со скоростью не менее 200 microliters per minute. Изготовьте несколько стеклянных микроэлектродов с сопротивлением от 6 до 10 mega ohm и заполните их примерно наполовину раствором для локальной фиксации мембраны (loose patch). Используя вертикальный флуоресцентный микроскоп с охлаждаемой CCD-камерой, найдите экспрессирующие GFP терминальные нервные нейроны gn RH three, начав с объектива 10 x.

Затем переключитесь на объектив 40 x и найдите нейроны на вентральной поверхности или рядом с ней в области обонятельных луковиц непосредственно перед головой (cephalon). Теперь переключитесь на видеомонитор, на который в реальном времени выводятся изображения с микроскопа. Кластер нейронов содержит от 8 до 10 GnRH-нейронов.

Поместите микроэлектрод в ванну регистрирующей камеры так, чтобы кончик электрода находился над целевым нейроном. Приложите постоянное небольшое положительное давление, чтобы предотвратить засорение микроэлектрода. Осторожно подведите кончик электрода к целевому нейрону, контролируя сопротивление электрода с помощью программного обеспечения Axo graft.

При использовании теста герметичности (seal test) в режиме фиксации напряжения (voltage clamp), когда кончик электрода касается поверхности нейрона, сопротивление электрода в этой точке незначительно изменяется. Сбросьте положительное давление, чтобы создать соединение с низким сопротивлением; при необходимости приложите легкое отрицательное давление. Наиболее важным этапом для качественной регистрации является выбор чистого участка нейрона, что поможет создать идеальную герметичную связь между электродом и мембраной.

Теперь переключитесь в режим фиксации тока (current clamp). Откройте программу PowerLab (Chart) и начните непрерывную запись мембранного потенциала без подачи тока; при необходимости отрегулируйте шкалу напряжения и скорость записи. Зарегистрируйте базовую электрическую активность в нормальном физиологическом растворе для рыб в течение примерно пяти минут до начала введения каких-либо препаратов. Перфузию препаратов, гормонов, пептидов и т. д. в препарат мозга следует осуществлять со скоростью потока 200 µL/min.

Затем используйте обычный физиологический раствор для рыб в течение периода промывки после поиска клетки; проверяйте и контролируйте сопротивление электрода в режиме фиксации потенциала. Когда кончик электрода окажется на поверхности нейрона и сопротивление электрода незначительно изменится, сбросьте положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление для создания герметичного соединения с высоким сопротивлением на нейроне.

Аккуратно создайте отрицательное давление ртом. Разрушьте пропатченную клеточную мембрану. После разрыва мембраны сопротивление мгновенно упадет примерно до 120–250 МОм.

Теперь переключитесь в режим фиксации тока (current clamp) и непрерывно регистрируйте мембранный потенциал с помощью графика без подачи тока. Снова при необходимости отрегулируйте масштаб напряжения и скорость записи. После проведения базовой записи электрической активности в обычном физиологическом растворе для рыб в течение примерно пяти минут введите препараты, после чего проведите период вымывания. Спонтанная электрическая активность терминальных нервов moca GNRH3-нейронов регистрировалась в режиме фиксации тока.

Типичная частота разрядов составляет от 0,5 до шести герц. Потенциалы действия обычно регистрируются в тоническом или пульсирующем режиме с достаточно регулярным межспайковым интервалом; средний мембранный потенциал между спайками составляет около минус 48 милливольт. Данный экспериментальный подход также успешно применяется для регистрации активности нейронов GNRH, меченных GFP, которые расположены в переднем мозге взрослых трансгенных животных.

Электрическая активность нейронов головного мозга трансгенных зебраданистых рыбок регистрировалась в вырезанном интактном мозге. Запись проводилась аналогично методу, описанному для DACA, с использованием техники loose patch. Эти же методы также обеспечивали регистрацию от всего нейрона (whole cell recording).

В отличие от нейронов GnRH терминального нерва в области meca, паттерн спонтанной активности потенциалов действия нейронов GnRH у zebrafish в предоперационной области, вентральном цефалоне и гипоталамусе часто бывает нерегулярным. После освоения эта методика позволяет провести 15-минутную запись за один час при правильном выполнении. Желаем удачи.