Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши
18 марта 2013 г.
Вирусные векторы позволяют целевой манипуляции генов. Мы демонстрируем метод условное выражение гена или абляции в спинном мозге мышей, с использованием стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге, известный сайт синаптических контактов между первичной соматосенсорной афферентов и нейронов центральной нервной системы.
Общая цель этой процедуры заключается в достижении пространственно ограниченной экспрессии генов в спинном мозге мыши путем стереотаксической инъекции вирусного вектора в поясничный дорсальный рог. Первым этапом процедуры является обнаружение и обнажение поясничного позвонка. Вторым шагом является удаление дорсальной части позвонка для того, чтобы обнажить спинной мозг.
Эта процедура называется ламинэктомией. Затем стеклянная пипетка, соединенная с микрошприцевым насосом, располагается над спинным рогом и опускается в спинной мозг. Заключительным этапом является медленное введение векторной суспензии.
Через две недели трансфекция нейронов дорсального рога демонстрируется экспрессией зеленого флуоресцентного белка, что позволяет отслеживать распространение вируса. Этот метод помогает выяснить функцию нейронов в некоторых сенсорных путях. Мы используем его в исследованиях, которые сосредоточены конкретно на развитии воспалительной или нейропатической боли.
Визуальная демонстрация имеет решающее значение для изучения того, как расположить мышь в стереотаксической рамке. Для успеха процедуры важно, чтобы позвоночник был зафиксирован правильно, потому что ламинэктомия является такой деликатной техникой. Мартин Моул, аспирант из моей лаборатории, продемонстрирует эту процедуру.
Джон Ванг, научный сотрудник, будет помогать ему за один или два дня до процедуры. Пул стеклянные пипетки позволяют получить диаметр наконечника 40 микрометров и скосить наконечник под углом 20 градусов в день операции. Начните процедуру с дезинфекции хирургического оборудования и подготовки стерильных хирургических инструментов для установки стереотаксической рамы.
Установите микрошприцевой инжектор на манипулятор и подключите устройство к сети. Прикрепите одну из стеклянных пипеток к микрошприцу с помощью компрессионного фитинга. Теперь извлеките поршень из микрошприца.
Наполните шприц минеральным маслом, затем снова вставьте поршень и нажмите на него до самого кончика. Осторожно избегайте образования пузырьков воздуха. Затем вставьте микрошприц в держатель на инжекторе.
Затем достаньте вирус из морозильной камеры и приготовьте суспензию вирусных частиц непосредственно перед использованием, разбавив ее стерильным фосфатным буфером до нужной концентрации частиц. Пипеткой нанесите пять микролитров вирусной суспензии на небольшой кусочек парама. Затем опустите стеклянный наконечник пипетки в каплю и потяните поршень, чтобы наполнить микрошприц.
В конце. Создайте небольшой пузырь воздуха на наконечнике пипетки, чтобы предотвратить его засорение. На этом этапе подготовьте операционную зону, протерев скамейку в грелке дезинфицирующим средством.
Затем обезболите мышь путем ингаляции изофтора. Затем нанесите смазку на каждый глаз, чтобы защитить их от высыхания во время операции После этого сбрейте шерсть от поясницы до шеи мыши. Дезинфицируйте кожу чередующимися салфетками с антисептиком местного действия, таким как хлоргексидин или повидон-йод, и 70% этанолом.
Затем инфильтрируйте место разреза 0,25% бупивакаином, разведенным один к 10 физиологическим раствором. Впоследствии надрезают кожу на брыльном конце грудной клетки, на два-три сантиметра по средней линии и отделяют фасцию, покрывающую позвоночник. Определите позвонок L, который расположен внушенным позвонку, удерживающему последнюю пару ребер, и обнажите его, удалив мелкие спинномозговые мышцы и связки, прикрепленные к его тыльной поверхности.
Затем слегка приподнимите и удерживайте позвонок L one с помощью пары аддиций и щипцов. Затем с помощью специальных щипцов для ламинэктомии удалите дорсальную часть позвонка, включая остистый отросток и пластинку, чтобы обнажить спинной мозг. Избегайте повреждения твердой мозговой оболочки или спинного мозга во время этой процедуры.
Затем перенесите мышь на нагревательную пластину в стереотаксическую рамку и следите за температурой мыши во время последующей работы. Теперь используйте шипы V-образной выемки, чтобы стабилизировать позвоночник, чтобы позвонок не двигался во время дыхания. Затем поднесите микрошприц ближе так, чтобы наконечник пипетки находился над местом ламинэктомии.
Опускайте поршень до тех пор, пока не увидите, как вирусная суспензия выходит из пипетки. Удалите капельку с помощью стерильной марли. Затем расположите кончик пипетки в самой ростральной части обнаженного спинного мозга.
Центрируйте пипетку над задней срединной бороздой и переместите наконечник на 500 микрометров в сторону. После этого опустите наконечник на поверхность шнура и проколите твердую мозговую оболочку. Впоследствии опустите кончик стакана, проведите пипетку на 300 микрометров в спинной мозг.
Вводите один микролитр вирусной суспензии со скоростью 200 нанолитров в минуту. В конце инъекции подождите не менее двух минут, прежде чем медленно втягивать пипетку. Повторите процедуру инъекции в большую часть обнаженного спинного мозга, чтобы добиться полного распределения вирусного вектора в сегменте L 4 спинного мозга.
Два места инъекции расположены рострально и примыкают к сегменту L четыре. Чтобы избежать повреждения тканей в целевой области после выпуска инъекции, позвонок L один из V-образного выреза зажимает и снимает мышь со стереотаксической рамки. Далее зашиваем фасцию пятью о Викрилом.
Закрытая фасция обеспечивает прикрытие для места ламинэктомии. Затем закройте кожу нейлоновыми швами или хирургическими скобами. Обеспечьте послеоперационную анальгезию в течение 72 часов с ежедневными подкожными инъекциями карпрофена в дозе пять миллиграммов на килограмм.
Переложите мышь в клетку для восстановления с мягкой подстилкой. Расположите мышь сбоку для комфортного дыхания. Затем наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в полную бдительность.
Скорая помощь и начинает пить. Контролируйте послеоперационное восстановление путем ежедневного осмотра в течение первых трех дней. Затем через день или три дня в неделю до завершения эксперимента.
Через 7-10 дней после операции, когда заживление раны завершено. Снимите с кожи швы или скобы. На этом рисунке показана экспрессия усиленного зеленого флуоресцентного репортерного белка или EGFP в левом дорсальном роге L четырех спинного мозга.
Через две недели после стереотаксической инъекции R-A-A-V-E-G-F-P нейроны были иммуноокрашены для ядер нейронов. Укажите на рассеянные трансфицированные глиальные клетки в дорсальном столбе. Примерно 80% нейронов в медиальном дорсальном роге были инфицированы практикой.
Процедура может быть завершена в течение 30-40 минут, при этом не забывайте поддерживать стерильные условия во время процедуры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять внутрисосновые хинальные инъекции в дозу ho спинного мозга мыши. Мы используем эту технику для манипулирования генами, но вы можете адаптировать ее для других целей, таких как внутриспинное применение лекарств.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен метод обеспечения пространственно ограниченной экспрессии генов в спинном мозге мыши посредством стереотаксического введения вирусного вектора в дорсальный рог поясничного отдела. Этот метод позволяет осуществлять направленную генетическую манипуляцию, в частности, в областях синаптических контактов между первичными соматосенсорными афферентами и нейронами центральной нервной системы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генная терапия
- Исследования спинного мозга
Теоретические сведения
- Вирусные векторы используются для манипуляций с генами.
- Дорсальный рог поясничного отдела является важным участком синаптических взаимодействий.
- Условная экспрессия генов может помочь в понимании нейронных механизмов.
- Стереотаксическая инъекция — это точный метод воздействия на специфические области мозга.
Цель исследования
- Для достижения направленной экспрессии генов в спинном мозге.
- Для изучения влияния генетических манипуляций на функции спинного мозга.
- Для создания методологической базы для будущих исследований.
Используемые методы
- Поиск и обнажение поясничного позвонка.
- Выполнение ламинэктомии для получения доступа к спинному мозгу.
- Использование стеклянной пипетки, подключенной к микрошприцевому насосу.
- Инъекция суспензии вирусного вектора в задний рог.
Основные результаты
- Успешное введение вирусного вектора в задние рога поясничного отдела спинного мозга.
- Кондициональная экспрессия гена, наблюдаемая в целевых нейронах.
- Метод продемонстрировал эффективность для пространственно ограниченной манипуляции.
- Потенциальное применение при изучении заболеваний спинного мозга.
Выводы
- Данный метод позволяет осуществлять точную манипуляцию генами в спинном мозге.
- Он может быть использован для исследования роли специфических генов в функционировании нейронов.
- Этот подход может расширить наше понимание физиологии спинного мозга.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стереотаксическое введение вирусных векторов обеспечивает точную, пространственно ограниченную манипуляцию генами в заднем роге спинного мозга мыши — ключевой области для исследования сенсорных процессов и путей передачи боли. Этот подход способствует валидации мишеней и механическому снижению рисков при поиске новых терапевтических средств в нейробиологии, позволяя осуществлять условную экспрессию или сайленсинг генов в определенных популяциях нейронов. Данный метод представляет собой воспроизводимую платформу для установления связи между генетическими мишенями и функциональными фенотипами в доклинических моделях боли, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки при выборе мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем обеспечения условной экспрессии генов в специфических популяциях нейронов спинного мозга.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный хирургический подход для обеспечения согласованного воздействия на дорсальный рог поясничного отдела во всех исследованиях.
- Прогностическая ценность: поддерживает фенотипический скрининг функций генов в путях передачи боли, помогая в оценке достоверности выбора мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели трансфекции (например, экспрессию EGFP) для оценки эффективности доставки вектора и клеточной специфичности.
- Практическая ценность: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений или модуляторов в моделях боли.
- Масштабируемость: краткость процедуры (30–40 минут) и быстрое восстановление животных способствуют увеличению пропускной способности в процессах поиска новых терапевтических средств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: Напрямую моделирует механизмы воспалительной и нейропатической боли, что соответствует приоритетам в области терапии.
- Трансляционная преемственность: Связывает модуляцию мишеней в спинном мозге с поведенческими фенотипами боли, что способствует доклинической валидации.
- Снижение рисков при разработке: Позволяет снизить механистические риски путем изоляции генно-специфических эффектов в релевантной для заболевания нейронной цепи.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки: от проверки гипотезы о мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинической валидации, особенно для мишеней ЦНС, участвующих в сенсорном восприятии.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая пространственно ограниченную манипуляцию генами в определенных областях спинного мозга.
- Скрининг: предоставляет количественные показатели (например, интенсивность флуоресценции, скорость трансфекции конкретных клеток) для оценки эффективности вектора и биологического эффекта.
- Аналитика: позволяет коррелировать эффективность трансфекции с функциональными результатами, что дает информацию для оценки зависимости «доза-эффект» и степени воздействия на мишень.
- Трансляционные исследования: связывает манипуляции с генами спинного мозга с фенотипами, связанными с болью, что поддерживает доклинические исследования, ориентированные на биомаркеры.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую хирургическую платформу, адаптируемую к различным вирусным векторам, промоторам или трансгенам в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет снижения побочных эффектов и повышения анатомической точности в исследованиях по манипуляциям с генами.
- Операционная ценность: способствует воспроизводимости за счет стандартизированных стереотаксических координат, параметров инъекций и послеоперационного ухода.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), обеспечивая механистическую ясность в отношении функций мишеней в путях передачи боли.
- Влияние на портфель проектов: облегчает приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе валидированных фенотипов спинного мозга.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения стереотаксических операций на грызунах, владение микрохирургическими методами и навыками выполнения асептических процедур.
- Необходимы специализированные инструменты, включая стереотаксическую раму, микрошприцевой насос и стеклянные пипетки со скошенным концом.
- Требуется стандартизированная подготовка вирусных векторов и проверка титра для обеспечения однообразной дозировки во всех экспериментах.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных сегментов спинного мозга, серотипов вирусов или полезной нагрузки трансгенов.
- Практические ограничения включают вариабельность хирургического вмешательства и тканевый ответ, которые должны контролироваться путем обучения оператора и стандартизации протокола.
