Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией

Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке влияния длительного нокдауна экспрессии intersecting one s на структуру и функцию легких мышей. Для этого на первом этапе подготавливаются специфические дуплексные липосомальные комплексы INA, предназначенные для воздействия на сосуды легких мыши. Комплексы INA-липосом вводят путем ретроорбитальной инъекции, которую повторяют каждые 72 часа в течение 24 дней подряд для достижения эффективного ингибирования экспрессии intersecting one S'S.

Затем образцы легочной ткани введенных мышей отбирают для биохимического анализа и электронной микроскопии с целью оценки уровней белка и мРНК intersectin 1, а также для проведения детального морфологического анализа легких. Результаты вестерн-блоттинга лизатов легких со специфическими антителами к intersectin 1 и анализ ОТ-ПЦР демонстрируют специфический и эффективный нокдаун intersectin 1 в течение 24 дней подряд. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методиками, такими как использование римерсов или лентивирусов, является то, что доставка ионизированных липосом в легкие воспроизводима, безопасна, нетоксична и высокоэффективна в эндотелии легких.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы решили оценить эффекты перекрестного подавления N in vivo, а другие методы доставки сРНК оказались неэффективными. Для приготовления катионных липосом добавьте 315 мкл стокового раствора диметилдиоцил-аммония бромида (DOAB) в круглодонную колбу, затем добавьте 200 мкл стокового раствора холестерина и 9,5 мл хлороформа, перемешав содержимое круговыми движениями. Присоедините колбу к роторному испарителю, настроенному на температуру 37 °C и скорость вращения 100 или более об/мин.

Полностью откройте первый клапан подачи аргона, повернув его по часовой стрелке. Всегда открывайте и закрывайте этот клапан первым. Второй клапан регулирует давление аргона, подаваемого в колбу.

Приоткройте его, чтобы обеспечить умеренное давление. Когда сухой лед начнет стекать по трубке, соединяющей газовый баллон Argonne с роторным испарителем, опустите роторный испаритель в водяную баню так, чтобы колба касалась воды, но не была погружена в нее полностью. Поверните регулятор скорости до 100–120 RPM. Когда весь хлороформ из колбы испарится, остановите прибор.

Поверните регулятор скорости роторного испарителя на ноль и закройте вентили баллона с аргоном. Извлеките колбу. Добавьте в колбу 2 мл 5% раствора глюкозы для ресуспендирования липидов.

С помощью наконечника дозатора на 1 мл тщательно поскребите дно колбы, чтобы полностью растворить все липиды. Инкубируйте полученный раствор в водяной бане при 42 °C в течение одного часа, медленно перемешивая содержимое колбы на вортексе. Обработайте раствор ультразвуком в течение минимум 20–30 минут, удерживая колбу вертикально так, чтобы ее дно едва касалось холодной воды в ультразвуковой ванне.

Затем нагревайте колбу в водяной бане роторного испарителя в течение 20 минут при 42 °C при нулевой скорости вращения, погрузив круглодонную колбу в воду. Профильтруйте липосомы через шприцевой фильтр с порами 0,47 мкм, а затем через шприцевой фильтр с порами 0,22 мкм. С помощью мини-экструдера профильтруйте липосомы через мембрану с порами 50 нм для получения гомогенной популяции униламеллярных липосомных везикул.

Перенесите липосомы в пробирку Эппендорфа и поместите на лед. Подготовьте комплексы липосом с рРНК ITSN в соотношении восьми моль липосом на два микрограмма РНК. В данном примере используется 50 µL I-A-I-T-S-N.

Из стокового раствора с концентрацией 50 micromolar добавляют объем раствора в 100 microliters свежеприготовленных липосом, используя пробирку EOR, не содержащую РНК и ДНК. Смесь следует держать на льду до момента введения мышам. Мыши, использованные в данном исследовании, имеют возраст от четырех до шести недель и вес около 25 grams.

Перед инъекцией убедитесь в полноте анестезии животного с помощью щипка за пальцы лапы. Используйте туберкулиновые шприцы объемом 1 мл с закрепленной иглой, удерживая шприц одной рукой. Возьмите мышь за уши и поверните её на бок, чтобы открыть внутренний угол глаза.

Направляйте иглу медиальнее полулунных складок PIKA, избегая касания глазного яблока. Поднесите заполненный шприц к слезному канальцу глаза под углом 45 градусов по всем трем осям. Медленно введите смесь, верните мышь в клетку и дайте ей восстановиться, лежа на стороне инъекции.

Мыши вводят siRNA против гена ITSN1 каждые 72 часа в течение 24 дней. Чтобы начать процедуру, убедитесь, что мышь полностью анестезирована, проверив отсутствие рефлекса отдергивания. Выполните лапаротомию и удалите диафрагму.

Затем выполните торакотомию, чтобы обнажить легкие и сердце. Удалите тимус, используя микроскоп StereoZoom для обеспечения более высокой точности. Проведите катетеризацию легочной артерии.

Затем выполните трахеостомию и проведите интубацию мыши через стому трахеи. Установите на аппарате ИВЛ частоту дыхания 150 циклов в минуту и дыхательный объем 150 µL. В качестве выходного отверстия используйте левое предсердие, обеспечив отток с помощью перистальтического насоса, настроенного на скорость 1,5 mL в минуту, используя раствор Хэнкса, подогретый до 37 °C.

Промывайте сосуды легких мыши до полного удаления крови в течение пяти минут, затем проведите перфузию с трейсером в течение 10 минут. После вымывания несвязанного трейсера выполните фиксацию легких in situ путем перфузии в течение 10 минут раствором, содержащим 4% formaldehyde, 2.5% gluar aldehyde и 1% tannic acid. Извлеките легкие и удалите излишки тканей.

Разрежьте легкие на небольшие блоки и перенесите их в маркированную сцинтилляционную пробирку, содержащую два миллилитра смеси фиксатора. Для начала подготовки ткани легких для электронной микроскопии сначала коротко трижды промойте блоки легких в 0,1 молярном натрий-цитратном буфере.

Затем фиксируйте образцы в 4% альдегиде и 2.5% глутаральдегиде в 0.1 фосфатном буфере в течение одного часа при комнатной температуре; после этого проведите постофиксацию 1% осмием тетраоксидом в течение одного часа в вытяжном шкафу на льду в темноте после однократного промывания буфером Каккенбергера. Инкубируйте образцы в буфере Каккенбергера в течение двух часов или в течение ночи при комнатной температуре. Промойте один раз в 50% этаноле, а затем проведите дегидратацию с использованием серии этанола возрастающей концентрации.

70% этанолом в течение пяти минут, 95% этанолом в течение пяти минут, а затем дважды в 100% этаноле по 15 минут. После этого перенесите в 100% пропиленоксид для двух инкубаций по 15 минут.

Удалите пропиленоксид и добавьте смесь из 50% пропиленоксида и 50% Epon 812. Инкубируйте образцы в течение ночи при комнатной температуре, вращая их на роторе. На следующее утро удалите смесь и добавьте свежий Epon 812; выдержите на роторе не менее четырех-пяти часов.

Поместите выбранные образцы в двухконусные формы, заполненные наполовину свежим 100%Epon eight 12. Расположите их по краям, перенесите формы в инкубатор при температуре 60 °C и оставьте для отверждения на 48–72 часа. Хроническое ингибирование экспрессии ITSN one s в течение 21 последовательного дня путем повторного введения липосомальных комплексов siRNA к I TSN one s приводит к значительному снижению уровней белка I TSN one в легких мышей, как показано на этих репрезентативных результатах: лизаты легких необработанного контроля и обработанных мышей были проанализированы методом вестерн-блоттинга с использованием антител к I TSN one и актину в нескольких временных точках после введения siRNA, как указано.

Денситометрический анализ репрезентативных вестерн-блоттингов белков CL и количественная ОТ-ПЦР мРНК I TSN one s дополнительно подтверждают, что обработка липосомальными комплексами siRNA к I TSN one s эффективно снижает экспрессию белка I TSN one s в легких мышей. Снижение уровней intersect in one приводит к нарушению эндоцитоза и эндотелиального транспорта, разрыву межэндотелиального барьера и развитию отека легких. На этих репрезентативных электронных микрофотографиях ткани легкого видны открытые межэндотелиальные соединения (IJs), помеченные по всей длине частицами альбумина с золотом размером 8 nm.

Панель A1 представляет собой увеличенное изображение панели A; наконечники стрелок указывают на три-четыре частицы золотого альбумина, расположенные близко друг к другу в одной плоскости, что свидетельствует о широком открытии IEJ. Частицы золота также связаны с аблюминальным выходом IJs, отмеченным стрелками на панелях A1 и B. Также обратите внимание на ограниченное количество CVE A и расширение перикапиллярного пространства, отмеченное звездочкой на панели A; резкое снижение экспрессии intersectin 1 привело к активации альтернативных путей транспорта для компенсации дефицита эндоцитоза.

На этих ЭМ-изображениях представлены мембранные кольца на панели A, плеоморфные канальцы на панели B и увеличенные эндосомы, слившиеся с типичными cve LA на панели C, которые активно участвуют в захвате и транспорте золоченого альбумина. Также наблюдается выраженное расширение периваскулярного пространства и белковый отек. Длительное ингибирование экспрессии intersect в течение 24 дней уменьшает отек легких у мышей за счет частичного восстановления целостности межэндотелиального барьера.

Морфологические исследования с помощью ЭМ показали, что трассер из альбумина с частицами золота размером 8 нм не мог проникнуть через IEJ в данный момент времени и вместо этого образовывал фильтрационные остатки в просветном устье соединения, отмеченном наконечником стрелки. Однако периваскулярные пространства или PVS демонстрировали некоторое расширение и легкий отек, что свидетельствует о непроницаемости соединений для частиц такого размера; при этом многовезикулярные тельца или MVB, расположенные в непосредственной близости к плазматической мембране, имели некоторые внутренние мелкие везикулы, помеченные частицами золотого альбумина размером 8 нм. В этой таблице приведено количество эндоцитозных трансцитозных структур в эндотелии легких контрольных мышей и мышей с дефицитом.

Значимым результатом стало снижение количества кавеол в эндотелии легких мышей с дефицитом ITSN1. Хроническое подавление экспрессии ITSN1 привело к активации альтернативных путей эндоцитоза и частичному снижению количества кавеол — мембранных колец или трубочек, маркированных частицами золотого альбумина. В эндотелии легких мышей с хроническим дефицитом ITSN1 данный показатель также увеличился в 14 раз по сравнению с контрольной группой.

После выполнения данной процедуры можно провести другие методы, такие как ELISA с использованием лизатов легких мыши, для количественной оценки трансэндотелиального транспорта различных hNIC-трейсеров. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как специфически доставлять комплексы ONIC-липосом и sRNA в эндотелий легких мыши для нокдауна целевого белка и оценки его функции.