GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении высокоочищенного полноразмерного целевого белка. Это достигается путем создания рекомбинантного бакуловируса, который используется для заражения клеток насекомых SF nine с целью получения высокоэкспрессируемой и растворимой версии целевого белка с двумя метками. Затем проводится двухэтапная аффинная очистка, которая включает очистку белка с GST-меткой с последующей металло-аффинной хроматографией.

Результатом очистки является высокочистый белок с гистидиновой меткой. Далее образцы очищенного белка подвергают диализу, чтобы обеспечить низкую концентрацию солей в буфере для хранения. На основании окрашивания всех белков в геле SDS-PAGE получают данные о растворимости экспрессированного белка, его количестве и качестве.

Идея этого метода возникла у нас, когда мы столкнулись с трудностями при очистке крупных и нестабильных белков, таких как PAL B two и BOC two. Таким образом, основным преимуществом данной методики перед существующими способами, например одностадийной аффинной очисткой, является то, что при использовании нашего протокола двухстадийной аффинной очистки полученный белок обладает высокой степенью чистоты и, как правило, не содержит продуктов деградации. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области биологии белков, такие как определение биохимических функций очищенных рекомбинантных белков.

Данный протокол начинается с получения рекомбинантного вируса baculovirus, после чего следует отбор наиболее эффективного вируса baculovirus, как описано в текстовом протоколе для проведения инфекции. Подготовьте сосуд для культуры в спиннере, содержащий от 0,75 до 1,0 × 10⁶ клеток SF9 в 500 мл среды при соотношении вируса к среде 1:150. Поместите спиннер под ламинарный шкаф для клеточных культур и инфицируйте клетки, добавив необходимый объем суспензии вируса baculovirus в клеточную суспензию через одно из отверстий спиннера.

Культивируйте инфицированные клетки в суспензии при 27 °C и соберите их при достижении максимальной экспрессии белка, время которой определяется при подборе наиболее эффективного бакуловируса. После сбора клеток лизируйте клетки Sf9, экспрессирующие целевой белок, примерно в 20 мл буфера для связывания GST с добавлением ингибиторов протеаз на ледяной бане. Пропустите раствор через гомогенизатор 20 раз, затем проведите соникацию в течение трех 30-секундных циклов и снова пропустите через гомогенизатор 20 раз. Далее центрифугируйте клеточный лизат при 18 000 об/мин в течение 30 минут при 4 °C и сохраните супернатант. Инкубируйте растворимую фракцию клеточного лизата с 1 мл предварительно промытых GST-бид в течение одного часа при 4 °C при осторожном перемешивании.

Время инкубации следует оптимизировать в зависимости от стабильности белка и эффективности связывания после завершения процесса. Выполните кратковременное центрифугирование при 700 RPM и удалите супернатант, содержащий несвязавшиеся белки. Промойте белки, связавшиеся с GST, буфером для промывки GST.

Повторите этот процесс дважды после последнего промывания. Удалите как можно больше супернатанта. Затем инкубируйте гранулы с 5 mM ATP и 15 mM хлорида магния в 10 мл буфера для связывания GST в течение одного часа при 4 °C, чтобы избежать неспецифического связывания белков теплового шока после инкубации.

Трижды промойте гранулы буфером для промывки GST. После центрифугирования гранул GST и удаления супернатанта промойте гранулы GST буфером P five. Затем разделите гранулы GST на фракции по 100 µL и добавьте от четырех до восьми единиц прецизионного фермента, разведенного в 100 µL буфера P five.

Инкубируйте GST-биды с ферментом от трех часов до ночи при температуре 4 °C при осторожном перемешивании. Время инкубации следует оптимизировать в зависимости от молекулярной массы и стабильности белка после расщепления. Кратковременно центрифугируйте и соберите супернатант.

Добавьте 100 µL буфера P five к гранулам. Затем повторите центрифугирование и сбор супернатанта дважды. Соберите все фракции.

Разделите EIT на три фракции по 1 мл и инкубируйте каждую с 100 µL предварительно промытых сухих бусин металлоаффинного сорбента Talon в течение одного часа при вращении; разделение элюции на несколько фракций повышает эффективность связывания и промывки. Затем промойте сорбент в течение пяти минут буфером P 30 при 4 °C при осторожном вращении. После двукратного повторения промывки соберите бусины в одну пробирку для элюции очищенного белка.

Добавьте буфер P 500 к смоле Talon с иммобилизованным белком. Соотношение объема буфера к объему гранул должно составлять 1:1. Инкубируйте суспензию в течение пяти минут при перемешивании на ротаторе.

Повторите этот шаг дважды. Храните каждую полученную фракцию отдельно для последующего сохранения очищенного белка. Проведите диализ белка против подходящего буфера для хранения дважды по одному часу при температуре 4 °C при перемешивании.

Важно проверять очищенный белок на предмет выпадения осадка во время диализа. Разлейте очищенный белок по небольшим аликвотам и заморозьте на сухом льду в течение 30 минут. Храните аликвоты при температуре -80 °C и избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.

Проанализируйте процесс очистки, нанеся примерно 20–40 µL каждой фракции на гель для SDS-PAGE. После проведения электрофореза окрасьте гель кумасси синим или другим красителем для белков для визуализации. Растворимые и общие клеточные лизаты клеток SF9, зараженных рекомбинантным вирусом вало REC 14 или незараженных (в качестве контроля), были проанализированы с помощью окрашивания кумасси синим, что позволило подтвердить экспрессию белка GST-RE 14-His в процессе очистки. Для оценки эффективности метода был проведен анализ большого количества образцов с использованием окрашивания кумасси синим.

Окрашивание показывает, что на первом этапе очистки GST Rec 14 правильно связался с GST-гранулами с кажущейся молекулярной массой примерно 50 киродальтон из-за слияния rec 14 с GST; после прецизионного расщепления по сайту G-S-T-G-S-T свободный rec 14 hiss мигрирует в районе 37 киродальтон. Несмотря на то, что часть свободного REC 14 осталась связанной с GST-гранулами, на них можно визуализировать расщепленный GST, при этом было достигнуто значительное обогащение REC 14 hiss. Данный этап можно улучшить, увеличив время инкубации белка с прецизионной протеазой. Анализ REC 14 hiss, связанного с Talon-гранулами, по сравнению с белками, элюированными после этапа очистки на GST-гранулах, показывает, что большая часть REC 14 hiss связывается с Talon-гранулами.

После нескольких промывок рекомбинантный белок REC 14 hiss был элюирован и собран; было проведено три этапа элюции. Анализ показал высокую степень чистоты REC 14 hiss, при этом наибольшая концентрация REC 14 hiss наблюдалась в первой фракции элюата; сравнение элюированных фракций с бусинами Talon после элюции демонстрирует эффективность процесса, так как на бусинах было обнаружено минимальное количество связанного REC 14 hiss.

Эти образцы также были подвергнуты вестерн-блот-анализу с использованием антител к GST и к His-тегу для отслеживания REC 14. На протяжении всей процедуры блот с анти-GST показывает, что некоторые GS TRE 14 и только GST присутствовали в белках, полученных на этапе очистки с помощью GST, и что загрязнения были удалены на этапе аффинной очистки по His-тегу. Данный блот подтверждает, что GST была эффективно удалена из re 14 путем прецизионной обработки и этапа очистки по His-тегу.

Вестерн-блоттинг на анти-His предназначен для обнаружения Rec 14. Данный блот подтверждает, что GST-Rec 14-His и REC 14-His были расщеплены и удалены с GST-бид не полностью. Кроме того, при высокой концентрации REC 14, по всей видимости, агрегирует.

Таким образом, представленные результаты демонстрируют эффективность очистки с помощью GST-His для выделения S palm B rec 14. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как восстанавливать высокоочищенный рекомбинантный белок, освоив данную методику.

При правильном выполнении данная методика может быть завершена в течение 12 часов после деградации растворимой лизосомной кислоты. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работать быстро и строго при температуре 4 °C, чтобы избежать деградации белка после проведения манипуляций. Для получения дополнительных данных, таких как идентификация белков-партнеров или определение посттрансляционных модификаций интересующего белка, могут быть использованы другие методы, например, анализ ко-преципитации или масс-спектрометрия.

Хотя мы используем этот метод для изучения белков репарации ДНК, данную стратегию можно модифицировать для исследования функций белков в других областях науки.