GST-Его очистка: Двухступенчатая Affinity Очистка Протокол Уступая полноразмерных очищенных белков

Общей целью следующего эксперимента является получение высокоочищенного полноразмерного белка, представляющего интерес. Это достигается за счет производства рекомбинантного вируса бао, который используется для инфицирования SF девяти клеток насекомых с целью получения высокоэкспрессированной и растворимой версии белка с двумя мечеными. Затем проводят двухступенчатую аффинную очистку, характеризующуюся очисткой глутатиона, белка, меченного серо, с последующей металлоаффинной хроматографией.

Результатом очистки является высокочистый белок, меченный гистидином. Затем образцы очищенного белка подвергаются диализу, чтобы гарантировать низкую концентрацию соли в буфере хранения. Получены результаты, которые показывают экспрессию, растворимость, количество и качество белка на основе окрашивания цельного белка гель-лист SDS.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда у нас возникли проблемы с очисткой больших и нестабильных белков, таких как PAL B 2 и BOC 2. Таким образом, основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как одноступенчатая аффинная очистка, заключается в том, что в нашем двухступенчатом протоколе аффинной очистки полученный белок является высокочистым и, как правило, не содержит продуктов распада. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области биологии белка, такой как биохимические функции очищенных рекомбинантных белков.

Этот протокол начинается с производства рекомбинантного вируса бао, за которым следует выбор наиболее эффективного вируса БА, как описано в текстовом протоколе для заражения. Приготовьте вращающийся питательный сосуд, содержащий от 0,75 до 1,0 умножить на 10 до шести SF девяти клеток в 500 миллилитровых средах с соотношением один к 150 между вирусом и средой. Поместите спиннер под колпак для клеточных культур, чтобы заразить клетки, добавив необходимый объем суспензии вируса баула в клеточную суспензию через одну руку спиннера.

Дайте инфицированным клеткам расти во взвешенном состоянии при температуре 27 градусов Цельсия и собирайте клетки при достижении максимальной экспрессии белка, которая определяется при выборе наиболее эффективного макулярного вируса. После забора клеток лиз SF девять клеток, экспрессирующих интересующий белок примерно в 20 миллилитрах буфера, связывающего GST, дополненных ингибиторами протеазы на ледяной водяной бане. Опустите раствор 20 раз с помощью гомогенизатора, затем обеспечьте ультразвуком в течение трех 32-х циклов, затем снова танцуйте 20 раз, центрифугируйте лизат клеток при 18 000 об/мин в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и держите надосадочную жидкость в инкубации растворимого лизата клеток с одним миллилитром предварительно промытых гранул GST в течение одного часа при четырех градусах Цельсия при мягком вращении.

Время инкубации должно быть оптимизировано в соответствии со стабильностью про и эффективностью связывания после связывания. Быстро отжмите при 700 об/мин и удалите надосадочную жидкость, содержащую несвязанные белки. Промойте белки, связанные с GST, промывочным буфером GST.

Повторите этот процесс два раза после последней стирки. Удалите как можно больше надосадочной жидкости. Затем инкубируйте шарики с пятью миллимолярами A TP и 15 миллимолярами хлорида магния в 10 миллилитрами связывающего буфера GST в течение одного часа при четырех градусах Цельсия, чтобы избежать неспецифического связывания белков теплового шока после инкубации.

Промойте бусины три раза с помощью буфера для стирки GST. После центрифугирования шариков GST и удаления надосадочной жидкости промойте шарики GST буфером P five. Далее разделите шарики GST, которые разделятся на 100 микролитров и добавьте четыре-восемь единиц прецизионного фермента, разведенного в 100 микролитрах P пяти буферов.

Инкубируйте шарики GST с ферментом в течение трех часов до ночи при температуре четыре градуса Цельсия при осторожном вращении. Время инкубации должно быть оптимизировано в соответствии с молекулярной массой, а также стабильностью белка после расщепления. Быстро вращайте и собирайте надосадочную жидкость.

Добавьте в бусины 100 микролитров буфера P five. Затем повторите, вращайте и набирайте надосадочную жидкость дважды. Вытягиваем все фракции.

Разделите EIT на три фракции по одному миллилитру и инкубируйте каждую со 100 микролитрами предварительно промытой смолы talon metal affinity в течение одного часа при вращении, разделив элюирование на несколько фракций, повышает эффективность связывания и промывки. Затем промойте смолу в течение пяти минут буфером P 30 при четырех градусах Цельсия с легким вращением. Повторив промывку два раза, вытяните бусины в одну трубку, чтобы вымыть очищенный белок.

Добавьте буфер P 500 в связанную с белком талонную смолу. Добавьте соотношение буфера и гранул в соотношении один к одному. Том. Инкубируйте суспензию в течение пяти минут при вращении.

Повторите этот шаг дважды. Хранение каждой ускользающей фракции отдельно для хранения очищенного белка. Диализуйте белок в соответствующем буфере для хранения два раза в течение одного часа при четырех градусах Цельсия при перемешивании.

Важно проверить наличие осадка очищенного белка во время диализа. Сделайте небольшие аликвоты из очищенного белка и заморозьте на сухом льду на 30 минут. Храните аликвоты при температуре минус 80 градусов по Цельсию и избегайте многих циклов замораживания.

Проанализируйте процесс очистки, загрузив примерно от 20 до 40 микролитров каждой фракции в гель SDS. После окрашивания геля синим или белковым окрашиванием для визуализации, растворимые и общие клеточные лизаты из девяти клеток SF, инфицированных рекомбинантным вирусом вало REC 14 или фиктивно инфицированных в качестве контроля, анализировали с помощью окрашивания синим цветом Кумаси, что позволило подтвердить экспрессию белка GST re 14 his в процессе очистки. Многие образцы были проанализированы для отслеживания эффективности метода анализа этих образцов с помощью kumasi Blue.

Окрашивание показывает, что на первой стадии очистки GST Rec 14 был правильно связан с гранулами GST с видимой молекулярной массой около 50 килодальтон из-за слияния Rec 14 с GST после прецизионного расщепления с G-S-T-G-S-T, свободное шипение rec 14 мигрирует около 37 килодальтон. В то время как расщепленный GST можно визуализировать на бусинах GST, несмотря на то, что часть REC 14, не содержащая GST, все еще оставалась связанной с бусинами GST, было достигнуто заметное обогащение шипения REC 14. Этот этап может быть улучшен за счет увеличения времени инкубации белка с помощью прецизионного протеазного анализа шипения REC 14, связанного с гранулами Talon, по сравнению с белками, упомянутыми после того, как стадия очистки GST показала, что большая часть шипения REC 14 связывается с гранулами Talon.

После нескольких промывок, шипение REC 14 было ускользнуло и собрано, было выполнено три иллюзии. Анализ выявил высокую чистоту шипения rec 14 и наибольшую концентрацию rec 14 шипения в первом эллуцианском сравнении ускользающих фракций с когтевыми бусинами после эллуцианского иллюстрирует эффективность иллюзии. Так как маленькое шипение rec 14 может быть обнаружено как связанное на бусинах.

Эти образцы также были подвергнуты западному анализу крови с антителами против GST и против шипения в соответствии с REC 14. На протяжении всей процедуры анти-GST блоттинг показывает, что некоторое количество GS TRE 14 и GST в одиночку присутствовало в упомянутых белках на стадии очистки GST и что загрязняющие вещества были удалены на стадии аффинной очистки hiss tag. Этот блоттинг показывает, что GST был эффективно удален из re 14 с помощью прецизионной обработки и этапа очистки с помощью шипящего ttag.

Антишипящий блот направлен на обнаружение re 14. Эта клякса подтверждает, что шипение GST Rec 14 и шипение REC 14 не были полностью расщеплены и удалены из шариков GST. Более того, при высокой концентрации REC 14, по-видимому, агрегируется.

Таким образом, представленные результаты демонстрируют эффективность очистки от шипения GST для очистки S ладони B rec 14. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как восстановить высоко ублаженную энергию. Комбинированный белок после освоения.

Этот метод может быть выполнен через 12 часов после дегенерации растворимой кислоты, если он выполнен правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно работать быстро и строго при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы избежать деградации белка после этой процедуры. Другие методы, такие как анализ преципитации кода или масс-спектрометрия, могут быть выполнены для ответа на дополнительные вопросы, такие как идентификация белковых партнеров или посттрансляционная модификация интересующего белка.

Хотя мы используем этот метод для ДНК, стратегия восстановления белков может быть модифицирована для изучения функции белков в других областях исследований.