Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Общая цель этой процедуры заключается в создании головных нейронов из человеческих эмбриональных стволовых клеток или H ESC путем прохождения через контрольные точки, которые аналогичны тем, которые наблюдаются во время развития человека. Это достигается за счет того, что ГСК сначала спонтанно дифференцируются в суспензии в среде HESC, а затем переносятся в среду нейронной индукции для более избирательной дифференцировки. Затем тела эмбрионов или агрегаты ПСК прикрепляются к обработанным культурой тканей планшетам, где клетки расширяются и дифференцируются в монослой.

С центрами, образующими нейроэпителиальные клетки, морфологически сходные с километровыми клетками. Затем нейроэпителиальные клетки выделяют и помещают в суспензионные культуры, где они образуют нейросферы. Наконец, нейросферы наносятся на покровные листы, где они могут еще больше дифференцироваться.

В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие конкретные типы нейронов, сформированных с помощью иммуноокрашивания или электрофизиологии. Применение этого метода распространяется на широкий спектр генетически наследуемых заболеваний, поскольку специфические нейроны пациента также могут быть сгенерированы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, где можно выяснить механизм действия, а также потенциальные методы лечения. Тем не менее, этот метод может дать представление о развитии талонов головных нейроподтипов из плюрипотентных стволовых клеток.

Он также может быть применен к другим системам, таким как болезни человека, связанные с талонными головными нейронами. Для создания агрегатов плюрипотентных стволовых клеток человека начните культивирование человеческих плюрипотентных стволовых клеток на мышиных эмбриональных фибробластах в среде HESC с добавлением основного FGF в течение пяти-семи дней, колонии будут большими, но все еще недифференцированными. Когда колонии достигли нужной стадии в 50 миллилитровую трубку. Приготовьте один миллиграмм на миллилитр раствора дис-боксов в среде D-M-E-M-F 12 согласно текстовому протоколу.

Отсадите среду из клеток, а затем промойте их один раз с помощью D-M-E-M-F 12. После удаления промывки добавьте по одному миллилитру дис-боксов в каждую лунку и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. На трехминутной отметке проверьте под микроскопом загнутые края, которые выглядят немного темнее.

При необходимости инкубируйте клетки дольше. Когда клетки будут готовы, удалите раствор дазы и промойте клетки один раз D-M-E-M-F 12, прежде чем заменить промывку 1,5 миллилитрами среды HESC, чтобы отделить и разрушить клетки. Расположите кончик стеклянной пипетки объемом 10 миллилитров на ячейках по направлению к нижней правой стенке лунки и небольшими движениями вверх и вниз перемещайтесь через лунку на другую сторону, прежде чем вернуться в обратном направлении.

Как только все клетки окажутся во взвешенном состоянии, поместите их в пробирки объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при температуре 200 G в течение двух минут, прежде чем удалить среду из гранулы. Используя среду HESC, перенесите клетки в колбу для культивирования. Например, для клеток из шести лунок ГСК используйте одну колбу Т 75 с 50 миллилитрами ГСК. Терпимая.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12 часов. Затем, чтобы удалить остатки клеток, переложите клетки и среду в 50-миллилитровую пробирку и промойте клетки один раз, прежде чем переложить их 50 миллилитров свежей среды в новую колбу. Продолжайте кормить клетки таким образом до пятого дня.

На пятый день раскрутите ячейки вниз и перенесите их в новую колбу T 75. С помощью 50 миллилитров нейроиндукционной среды или NIM инкубируйте их в течение двух-трех дней, заменяя половину NIM каждый день после инкубационной пластины, клетки используют либо ламинин, либо FBS, чтобы помочь им прикрепиться к пластинам к пластинам. С помощью FBS добавьте в каждую по 1,5 миллилитра среды с ячейками.

Хорошо аккуратно встряхните пластину, чтобы разложить агрегаты и дать ячейкам прикрепиться на ночь. При 37 градусах Цельсия на следующий день замените всю среду двумя миллилитрами NIM на лунку. Через день или два инкубации каждый агрегат расползается, образуя монослой, и в течение пары дней центры большинства этих клеток морфологически станут похожими на клетки колумера.

Примерно через 14-17 дней клетки колумера будут казаться более компактными. Иногда клетки образуют гребни или кольца с видимым просветом внутри. Прежде чем изолировать клетки, исследуйте их на наличие эпителиальных клеток, отличных от ЕС, и используйте наконечник пипетки, чтобы соскоблить их.

Изолировать нейроэпителиальные клетки, которые находятся в центре колоний. Используйте микропипетку и стерильную пипетку с фильтром объемом один миллилитр, чтобы надавить на центр колонии, чтобы она оторвалась. Следите за тем, чтобы внешняя часть колонии также не отделилась.

Перенесите две пластины с изолированными клетками в 15-миллилитровую пробирку и вращайте при 200 G в течение двух минут. После удаления среды перенесите клетки в колбу T 25, не обработанную тканевой культурой, содержащую 10 миллилитров NIM. С добавлением В-27 инкубируйте в течение ночи на следующий день, клетки должны иметь сферический вид.

Иногда периферические клетки также будут изолированы, и они обычно прикрепляются к дну колбы. Если это произошло, переложите сферические ячейки в новую колбу, оставив прикрепленные клетки после культуры. Нейросферы и суспензия в течение одной недели в NIMB 27 для повышения выносливости и пролиферации клеток.

Добавьте циклический А МП и инсулиноподобный фактор роста один. В конце недели нейросферы будут содержать головных прародителей и будут готовы к нанесению на покровные листы для терминальной дифференциации. Для приготовления покрытых полиуретаном ламинина покровных листов в 24 лунки пластины начинают с покрытия чистых покровных стеблей 0,1 миллиграмма на миллилитр раствором полиуретана при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи и покрывают покровные стекла ламинином в концентрации 50 микролитров 20 микрограмм на миллилитр ламинина в нейронной дифференцировке.

Среднее значение для каждого покрытия, обработанного полиуретаном. Будьте осторожны, чтобы жидкость, касающаяся крышки, соскользнула только с самой крышкой. Инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух часов.

После инкубации ламинина соберите и промойте нейросферы в D-M-E-M-F 12. Если клетки слишком велики для правильного прикрепления, добавьте около двух миллилитров Аккутана и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Затем добавьте равный объем ингибитора трипсина и после центрирования клеток при 200 G в течение трех минут, замените раствор на NDM и используйте P 200 для разбиения клеток на небольшие кластеры.

Поместите их на предварительно покрытые покровные листы, аспирируйте большую часть среды и перенесите клетки в шестисантиметровую чашку Петри в нескольких каплях среды, чтобы их выбор был легче выбрать, не удаляя ламинин с предварительно покрытых покровных стеблей. Перенесите в каждую из них от четырех до пяти нейросфер. Дайте нейросферам прикрепиться не менее двух-четырех часов, прежде чем добавлять 0,5 мл нейродифференцировочной среды, дополненной циклическим витамином B 27.

МП и нейротрофические факторы заменяют половину среды через день. Клетки могут содержаться в течение нескольких месяцев, как показано здесь. В этом протоколе описывается, как дифференцировать человеческие ПСК в когтистые цефальные глутаматергические нейроны с помощью нескольких критических этапов.

Образование ПСХ объединяет индукцию нейроэпителиальных клеток, генерацию талонных головных предшественников и конечную дифференцировку этих предшественников в талонные цефальные нейроны. Эта система надежна и эффективна, например, при генерации головных, прогениторных и глутаматергических нейронов. Без добавления изирующих факторов ГСК дифференцировались по нейронной линии и через 24 дня после дифференцировки.

Большинство нейронных предшественников были положительными для Fox G one, транскрипционного фактора А, экспрессируемого головным мозгом, но отрицательными для HOKs B 4, маркера А для клеток заднего головного и спинного мозга, что позволяет предположить, что были успешно сгенерированы телоновые предшественники головного мозга. Эти телоновые головные предшественники обладают дорсальным фенотипом, на что указывает экспрессия PAC six. Маркер, экспрессируемый дорсальными предшественниками, но не маркером NK X 2.1 A для вентральных предшественников.

После дальнейшей дифференцировки эти головные дорсальные предшественники дифференцировались в глутаматергические нейроны, которые были положительными по глутаматергическому маркеру. Нейроны TBR One, которые были положительными на TBR one, также были положительными на нейронные маркеры бета-3 тубулин или карту 2. Эти клетки также экспрессировали везикулярный транспортер глутамата one или V glut one, маркер зрелых глутаматергических нейронов, что позволяет предположить эффективную генерацию талонных цефальных глутаматергических нейронов в культуре.

После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как электрофизиология, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, могут ли эти нейроны создавать синаптические связи с другими клетками. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание. Он должен был дифференцировать человеческие плюрипотентные стволовые клетки в головные глутаматергические нейроны через несколько критических этапов.

Образование плюрипотентных стволовых клеток агрегирует индукцию нейроэпителиальных клеток, генерацию головных предшественников и терминальную дифференцировку этих предшественников в головные нейроны.