В естественных условиях измерения мышь легочных эндотелиальных поверхностного слоя

Общей целью данного эксперимента является измерение ширины поверхностного слоя эндотелия легочной микрососудистой артерии или ESL путем измерения исключения флуоресцентно меченных декстринов с высокой массой тела с поверхности сосуда. Это достигается путем предварительного проведения внутривитальной ДВС-микроскопии для идентификации мембран эндотелиальных клеток субплевральных микрососудов в движущемся мышином легком. Затем мышам вводят высокомолекулярный флуоресцентно меченный декстрин, который исключается из стенки сосуда невидимым в противном случае эндотелиальным поверхностным слоем.

Затем одновременные ДВС-и флуоресцентные изображения захватываются из одного фокусного кадра, что позволяет измерять ширину сосудов, которая соответственно включает и исключает толщину ЭСЛ. Разница между шириной ДВС-синдрома и флуоресцентного сосуда используется для определения толщины субплевральной микрососудистой ЭСЛ. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как велосимметрия микрочастиц, заключается в том, что она может быть точно выполнена в движущемся органе, таком как легкое, демонстрируя эту процедуру доктору Иму Янгу, старшему научному сотруднику из моей лаборатории.

Отрежьте кусок трубки PE 50 длиной 10 сантиметров и прикрепите один конец к тупому концу изогнутой иглы 23 калибра. С помощью иглы 30 калибра многократно проколите дистальный конец трубки, создавая боковые порты для облегчения эффективной аспирации внутригрудного воздуха с помощью шелкового шовного материала из четырех ох. Отделите фенестрированную часть от остальной части трубки, сделав несколько окружных петель, которые будут служить стопором и закрепить фенестрированную часть в грудной полости.

Подготовьте окно в стенке сундука, вырезав прозрачную поливаниловую мембрану в овал, и с помощью клея альфа-цианоакрилата наклейте круглую пятимиллиметровую форму. Крышка номер один: наденьте на нее после обезболивания мыши, побрейте и продезинфицируйте операционную область и закрепите ее на разделочной доске. Под рассекающим скопом сделайте разрез в один сантиметр над горлом.

Рассекают подлежащую соединительную ткань и с боков отделяют и отражают слюнные железы. Протяните петлю из четырех швов под трахеей. Затем разрежьте его, чтобы создать две отдельные нити шва.

Двумя пальцами возьмитесь за верхний шов и мягко натяните трахею. Затем сделайте горизонтальный разрез, который пересекает примерно две трети окружности трахеи между верхним и нижним швами. Вставьте флановую трахеостомическую трубку в дистальный отдел трахеи.

Используйте шовный материал для трахеи кодал, чтобы зафиксировать трубку на месте. Определите яремную вену, прослеживая ее венозные ветви проксимально. Наружная яремная кость находится под отраженными слюнными железами.

Это можно проследить проксимально. Чтобы найти наружное внутреннее яремное соединение, используйте мягкое тупое рассечение, чтобы отделить яремный переход от окружающей соединительной ткани. Затем четырьмя ох швами перевяжите наружную яремную и внутреннюю яремные вены краниально к яремному соединению.

Затем сделайте небольшой надрез в киле яремного перехода и постепенно продвигайте через него два катетера в яремный ствол. После мягкой аспирации, чтобы обеспечить возврат крови, используйте четыре шва, чтобы закрепить катетеры внутри вены. После того, как мышь будет переведена на ранее подготовленный этап микроскопии, продлите разрез по средней линии от шейки до мечевидного отростка.

Затем двигайтесь сбоку в правую сторону. С помощью электрокаутеризации удалите грудную мускулатуру, чтобы обнажить грудную клетку. Заботясь об обеспечении полного гемостаза.

Скрестите правую заднюю лапу мыши над левой стороной и прикрепите ее скотчем. В результате перекрута брюшной полости немного вращается грудная клетка, что облегчает хирургическое вмешательство. Расположите сцену под углом 45 градусов, чтобы легкое отпало от грудной стенки после индуцирования пневмоторакса.

Далее с помощью щипцов обхватите первое ребро и тупо. Протолкните изогнутые щипцы под ребро, чтобы отделить теменную плевру от грудной стенки. Затем разорвать плевральную поверхность и вызвать пневмоторакс, не повреждая нижележащее легкое.

С помощью продувочной трубки и шприца с усилием введите воздух против теменной плевры. С помощью электрокоагуляционных щипцов рассеките мускулатуру грудной стенки и разрежьте пятое и шестое ребра и теменную плевру, сделав около восьмимиллиметрового круглого отверстия в грудной стенке. Важно поддерживать полный гемостаз, так как наличие кровотечения будет затруднять микроскопию.

С помощью игловодителя введите торакостомическую трубку в отверстие грудной стенки. Иглой следует проколоть грудную стенку и выйти из грудной полости снизу и латерально к грудному окну. Осторожно вытяните трубку из стенки грудной клетки до тех пор, пока не почувствуете сопротивление со стороны шовной пробки, расположенной на краю фенестрированной части трубки.

Поставьте сцену на плоскую поверхность и добавьте в вентилятор три сантиметра положительного давления воды и выдоха. Чтобы помочь расширению легких, нанесите клей по кругу вокруг окна грудной клетки. Прикрепите мембрану со стеклянной крышкой, обращенной наружу, к грудной полости.

С помощью ватного аппликатора осторожно приблизьте мембрану к клею, выполняя маневр рекрутирования легких, нанесите отрицательную трехмиллиметровую ртутную аспирацию через плевральную дренажную трубку. Легкое должно настойчиво аппроксимировать мембрану при свободном движении во время дыхательной вентиляции для реанимации, а также обеспечивать индикатор для измерения эндотелиального поверхностного слоя или ЭСЛ сразу после закрытия. Через яремный венозный катетер через яремную венозную стенку вводится 500 микролитров меченного 150 килодальтон декстрина.

Чтобы визуализировать небольшие различия в толщине ESL, выберите объектив с числовой апертурой больше 0,8, которая поддерживает рабочее расстояние от двух до трех миллиметров. После того, как капля воды была помещена на центр скольжения крышки, объектив погружения в воду наносится на него. Чтобы точно измерить толщину ESL в движущемся органе, используйте разделитель изображений для одновременной съемки светлопольных изображений DIC и изображений Fit E.

Из фокусной рамки определите субплевральные микрососуды, измерьте ДВС-синдром и подгоните ширину сосудов с помощью декстрина, усреднив длины трех перпендикулярных пересечений на микрососуды, предполагая равную толщину ESL на обоих краях сосуда. Размер ESL может быть определен на половину разницы между шириной сосудов DIC и декстрина Фитца. Альтернативные методы измерения и процедуру эвтаназии см. в текстовом протоколе, показанном здесь, одновременно захватываются DIC и флуоресцентные изображения микрососудов субплевральной микрососудистой сети мыши.

Ширина измеряется с помощью среднего значения трех перпендикулярных линейных пересечений. Толщину ESL можно определить с точностью до половины. Разница между шириной микрососудов DIC, которые включают ESL и флуоресцентные микрососуды.

Измерения, которые исключают измерения E-S-L-D-I-C, точно определяют границы стенки субплеврального сосуда, о чем свидетельствуют почти идентичные измерения ширины сосудов DIC и GFP, выполненные на эндотелиальных флуоресцентных связях двух мышей GFP. Сплошная линия представляет собой линию идентичности, как показано на этом графике. Субплевральный микроциркуляторный русло может прослеживаться в продольном направлении, о чем свидетельствует прогрессирующая потеря толщины ЭСЛ, происходящая после внутривенного введения липополисахарида.

Целостность гликокаликса может быть определена путем оценки адгезии анти-ICAM к одной микросфере в субплевральной сосудистой сети, как показано здесь. Высокоскоростная конфокальная микроскопия захватывает адгезивные флуоресцентные микросферы через 45 минут после внутривенного введения ЛПС Обратите внимание, что можно увидеть, как циркулирующие микросферы проходят через микроциркуляцию для улучшения визуализации локализации микросфер, мышей предварительно обрабатывали сосудистым индикатором тридекстрином вместо Zi декстрина. При выполнении этой процедуры важно помнить, что DIC и флуоресцентные изображения должны быть сняты одновременно.

Даже небольшая задержка между двумя изображениями помешает точному измерению ESL в движущемся органе.