Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

Для получения макрофагов на основе костного мозга для поляризационного анализа. Бедренные и большеберцовые кости выделяются у мышей и собираются клетки костного мозга. Затем клетки культивируют в среде, содержащей факторы роста, чтобы индуцировать образование макрофагов.

После семи дней культивирования макрофаги, полученные из костного мозга, обрабатывают различными стимулами и поляризованными макрофагами. Ответы активации анализируются с помощью проточной цитометрии, ПЦР в реальном времени, и получены результаты анализа вестерн-блос, которые показывают высокую чистоту макрофагов, полученных из костного мозга, с поляризованными активационными ответами на М1 или М-2. Раздражители лгут.

Применение этого метода заключается в терапии или диагностике различных заболеваний, связанных с инсулином, в том числе инсулинорезистентных и CRO, поскольку Т-инфильтрирующие макрофаги являются основным игроком в этом контексте, визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку ускорение клеток костного мозга несколько затруднено, а выход имеет решающее значение для получения достаточного исследуемого клеточного препарата для индуцирования образования макрофагов Работая в стерильном капюшоне. Начните этот протокол с бедренной и большеберцовой костей, выделенных у мышей в возрасте от шести до восьми недель в чашке для культивирования тканей. Промойте кости в PBS, затем с помощью ножниц разрежьте оба конца костей, стараясь не удалить слишком много, удерживая кость щипцами.

Введите иглу 21 на 23 калибра с 10-миллилитровым шприцем, содержащим холодный PBS с 2% нагреванием, активированным FBS, в один конец кости. Нажмите на поршень, чтобы вымыть костный мозг в новую чашку для культуры тканей. Затем пропустите костный мозг через ту же иглу четыре-шесть раз, чтобы диссоциировать клетки.

Затем налейте клетки в сетчатый фильтр для клеток 70 микрон, чтобы удалить клеточные комки, кости, волосы и другие клетки или ткани. Соберите поток через 50 миллилитров в коническую трубку. После того, как раствор пройдет через фильтр, добавьте в сквозной поток три объема 0,8% хлорида аммония и выдерживайте на льду в течение 10 минут.

Чтобы удалить эритроциты после инкубации, вращайте клетки в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После отжима повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20-50 миллилитрах холодного PBS с 2% FBS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Вращайте ячейки при 500-кратной G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После вылить супинат. Продолжайте индуцировать образование МПК, как описано в следующем разделе протокола: Чтобы индуцировать образование ММДМ Resus, суспензируйте изолированные клетки костного мозга в питательной среде МПКМ в концентрации в два раза.

Центрируйте шесть клеток на миллилитровое семя от одного до двух умножить на 10 к шести клеткам в каждой лунке шести- или 12-луночного планшета для культивирования тканей и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия. Посев в такой концентрации облегчит отслоение для проточной цитометрии через три дня. Смените на свежую среду роста BMDM на седьмой день.

Формирование зрелой МПКТ оценивают с помощью анализа проточной цитометрии и фторконъюгированных антител для обнаружения клеток, экспрессирующих CD 11, B и F, 4 80. После проверки образования зрелого BMDM, замена на свежую является модифицированной средой Коува с 10% FBS и LPS или LPS и интерфероном гамма для активации M1 или IL 4 или IL 13 для активации M two. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия через 24 часа.

Соберите стимулированные b MDM, отделив их от чашки. Для этого удалите среду из клеток и промойте PBS без кальция или магния. Затем добавьте теплый 0,05% трипсин, содержащий 0,48 миллимоляра, ЭДТА инкубировать при 37 градусах Цельсия не более 10 минут, чтобы избежать потери поверхностных белков из-за переваривания.

Затем дважды промойте клетки PBS, содержащим 10% FBS, и переложите их в пробирки для образцов объемом 1,2 миллилитров. Используйте антитела для обнаружения экспрессии антигенов клеточной поверхности, включая CD 11 BF четыре 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 или CD 86 в различные моменты времени. Использование стандартных процедур окрашивания проточной цитометрией с использованием количественной ПЦР.

Определите уровни экспрессии IL 1, бета TNF альфа и IL 6 для оценки активации M1 или IL 10, IL 13, аргиназы 1 и PPAR гамма для оценки активации M 2. Наконец, проведите вестерн-блоттинг для оценки активации клеточных сигнальных путей, участвующих в активации двух макрофагов M1 или M, для оценки чистоты зрелых BMDM. Последующий индукционный проточный цитометрический анализ проводили с использованием антител против CD 11 BF four 80, CD 11 C и CD 2 0 6 B. MDM сначала загуливали на FSC и SSC для удаления DRI и конъюгатов.

Зрелые b MDM были определены как CD 11 B положительные F четыре 80 положительные субпопуляции, которые видны в верхнем правом углу этого графика и скомпрометировали от 95 до 99% закрытой популяции для оценки поляризации макрофагов. Был проведен дальнейший анализ. Первое гейтирование было проведено для идентификации инфильтрированных в ткани макрофагов, которые являются CD 11 B положительными F, четырьмя 80 положительными клетками.

Среди них М1 макрофаги, которые CD 11 С положительны и CD 2 0 6 отрицательны, появляются во втором квадранте, тогда как М два макрофага, которые CD 11 С отрицательны и CD 2 0 6 положительно появляются в четвертом квадранте. Для оценки активации макрофагов клетки инкубировали либо с ЛПС, чтобы индуцировать активацию М1, либо с IL четыре для активации М-2. При активации размер макрофагов увеличивался, о чем свидетельствует сдвиг FSCA М1 или М-двух макрофагов через 24 часа после стимуляции по сравнению с М-нулем без лечения.

Также были проанализированы поверхностные маркеры, связанные с активацией макрофагов после стимуляции. Маркеры раннего ответа CD 69 оценивали через 5 или 24 часа после стимуляции, маркеры CD 80 и CD 86 анализировали через 48 часов после стимуляции. Как показано на рисунке, повышенное содержание поверхностных CD 69, CD 80 и CD 86 наблюдалось у стимулированных макрофагов для оценки классической и альтернативной активации макрофагов.

Те, кого стимулировали либо ЛПС, либо IL 4 в течение 24 часов, собирали, и выделяли общую РНК для анализа с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как показано здесь. Повышенная экспрессия аргиназы 1 и гамма-фага PPAR была обнаружена в макрофагах М-2 по сравнению с экспрессией провоспалительных цитокинов в необработанных макрофагах. Интерлейкин 1 бета TNF альфа увеличивался в макрофагах M1 для оценки активации пути NF каппа B антителами ЛПС против P 65 и связанного с фосфо P 65 были использованы в вестерн-блоттинге, как показано здесь.

Более сильная полоса против фосфорилированного P 65 наблюдается при лечении ЛПС. В совокупности эти данные указывают на макрофаги, полученные из костного мозга, с поляризованными активационными реакциями на М1 или М-два стимула. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить макрофаг, полученный из костного мозга, с последующим поляризованным активационным анализом.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости оценить чистоту дифференцированных макрофагов, прежде чем проверять их реакцию. После этой процедуры может быть выполнен такой метод, как транзиторная трансфекция генов или SHRA, чтобы ответить на дополнительный вопрос, например, как гены участвуют в регуляции активации макрофагов?