Микрофлюидных Изготовление Чип и метод для выявления гриппа

Общая цель следующего эксперимента заключается в обнаружении вируса гриппа А с использованием микрофлюидного чипа. Сначала пропустите образец с лизирующим буфером через канал ТФЭ (твердофазной экстракции) для лизиса вируса и экстракции РНК; затем внесите реагент для РТ-ПЦР с экстрагированной РНК и запустите канал обратной транскрипции для преобразования вирусной РНК в кДНК. Далее пропустите смесь в канал ПЦР для амплификации ДНК; в результате будут получены данные о размере и концентрации ампликона на основании флуоресцентного сигнала капиллярного электрофореза.

Основным преимуществом данной технологии является возможность использования необработанного образца пациента, а также интеграция этапов экстракции, очистки, обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот в одном чипе. Для изготовления двух пластин равномерно распределите примерно девять граммов гранул XN X в центре металлической пластины и поместите ее в пресс, нагретый до 198 °C, на пять минут. Затем медленно увеличьте давление до 2 500 PSI и выдержите еще пять минут. Теперь поместите одну пластину в форму из эпоксидной смолы, предварительно нагретую до 157 °C в течение 10 минут, и медленно увеличьте давление до 1000 PSI еще на 10 минут.

Затем, используя термостойкие перчатки, извлеките пластину и форму из горячего пресса, после чего выньте пластину из формы до того, как она остынет. Просверлите три отверстия в рельефном чипе: по одному у входа, порта для отходов и выхода микрофлюидного канала. Затем промойте чипы изопропиловым спиртом (IPA), затем раствором RNAs away и деионизированной водой.

Высушите чипы с помощью потока воздуха. Для склеивания чипов сначала проведите предварительный нагрев при 131 °C в течение 10 минут, затем подвергните их прессованию при 350 PSI еще в течение 10 минут. С помощью эпоксидного клея JB Weld прикрепите нанопорты к входному сточному и выходному портам; полимеризацию проводят в течение 15–24 часов. Согласно инструкциям производителя, промойте канал SPE 50 µL раствора RNAs away, а затем 100 µL воды, свободной от нуклеаз.

Теперь введите в канал ТФЭ 4 µL свежеприготовленного раствора для прививки, чтобы сшить метакрилат; инкубируйте в УФ-камере в течение 10 минут, затем удалите остатки раствора для прививки с помощью вакуума. Разбейте высушенный осадок микросфер, постукивая по пробирке с закрытой крышкой. Затем добавьте 100 µL свежеприготовленного раствора для колонки ТФЭ и перемешайте на вортексе.

Внесите 4 µL раствора SPE в тот же канал и проведите сшивание путем УФ-облучения в течение 2,5 минут с каждой стороны, в результате чего образуется непрозрачная белая полимеризованная колонка SPE. Промойте канал 500 µL 100% метанола, чтобы удалить избыток реагентов и внутриполимерные пирогенные растворители. Прикрепите два тонкопленочных нагревателя к нижней части чипа с помощью теплопроводящей ленты.

Обратите внимание, что стороны нагревателей должны быть выровнены по краю широких каналов. Затем отдельно поместите пять термопар в чип через тупиковые открытые боковые каналы каждой ленты чипа. Чтобы зафиксировать положение термопар, добавьте 4 µL 25 X RNA secure к 96 µL 70% этанола в одной пробирке и к 100% этанола во второй пробирке. Также подготовьте 300 µL канального буфера и 316 µL лизирующего буфера.

Нагревайте растворы при 60 °C в течение 15 минут для активации RNA secure, а затем для уравновешивания микрофлюидного канала. Пропустите буфер канала через канал SPE со скоростью потока 0.8 мл/ч.

Теперь быстро разморозьте образец фавы в VTM при 37 °C. Извлеките образец сразу после размораживания. Центрифугируйте образец при 13 000 об/мин в течение 10 минут.

Перенесите 100 µL супернатанта в 300 µL лизирующего буфера, добавьте 6 µL носителя РНК в концентрации 1 µg/µL и перемешайте на вортексе. Затем центрифугируйте в течение 5 секунд и загрузите весь лизат в шприц объемом 1 CC с Luer-Lock. Пропустите лизат через канал SPE со скоростью потока 0,8 mL/h.

Затем промойте канал SPE 100 µL 70% этанола, после чего промойте его 100 µL 100% этанола со скоростью 1 mL/ч. Установите пустой шприц на отметке 0,5 mL и продуйте канал воздухом для его высушивания со скоростью 1 mL/ч. Теперь пропустите через канал 67,5 µL воды, свободной от нуклеаз, со скоростью 0,5 mL/ч для элюирования связанных нуклеиновых кислот и соберите 13,5 µL из нанопорта в выходном порту для отходов.

Загрузите 36,5 µL мастер-смеси для RT-PCR. Смешайте её в нанопорту у порта для отходов с матричной РНК для получения 50 µL реакционной смеси RT-PCR. Затем осторожно с помощью вакуума загрузите смесь для RT-PCR в канал RT.

Герметизируйте нанопорт с помощью закрытого фитинга. Подайте напряжение 35 В на первый нагреватель. Выдержите реагенты в канале RT в течение 30 минут после того, как температура первого нагревателя стабилизируется на отметке 50 °C.

Выдержите реагенты в канале RT в течение 15 минут после достижения первым нагревателем температуры 95 °C. Затем подайте напряжение 27 В на первый нагреватель и 50 В на второй нагреватель, чтобы установить температуру первого нагревателя на уровне 60 °C, а второго — на уровне 95 °C. Переместите реагенты в канал PCR со скоростью 0.5 µL в минуту.

Примерно через 20 минут, когда реагенты достигнут конца серпантинного канала, соберите продукты ПЦР на выходе, используя дозатор и наконечник подходящего размера для высокочувствительного теста ДНК Agilent. Извлеките набор для высокочувствительного анализа ДНК Agilent из холодильника за 30 минут до начала тестирования. Включите биоанализатор и запустите программное обеспечение 2, 100 expert.

Загрузите 1 µL продуктов ПЦР для анализа и следуйте протоколу Agilent. Проанализируйте и запишите данные в данном рабочем процессе. Образец из носоглотки пациента смешивают с лизирующим буфером и наносят на чип.

Чип запускают, и ПЦР-продукты вируса гриппа считывают с помощью коммерческого чипа для капиллярного электрофореза. Из-за различного количества вируса гриппа в образцах каждого пациента конечная концентрация ПЦР-продукта будет варьироваться. Хороший результат для положительного образца должен характеризоваться низким уровнем шума, четкими пиками маркера молекулярного веса при 35 и 10 380 п.н., а также одиночным пиком продукта расчетного размера 107 п.н.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготовить и использовать микрофлюидный чип для обнаружения вируса гриппа.