Формирование человеческого эпителия простаты с использованием тканевых Рекомбинация грызунов мочеполовой Мезенхима Синус и стволовых клеток человека

Общая цель этой процедуры заключается в выделении урогенитальной, мезенхимы синуса или UGSM грызуна из эмбрионов грызунов и имплантации смесей тканей в почечную капсулу, которая может формировать эпителий предстательной железы человека. Это достигается путем первичной изоляции урогенитального синуса от эмбрионов мышей или крыс. Далее мезенхима урогенитального синуса отделяется от эпителия.

Затем одноклеточные суспензии мезенхимы урогенитального синуса комбинируют с плюрипотентными стволовыми клетками. Наконец, клеточная смесь имплантируется под почечную капсулу мыши-хозяина. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что эпителий предстательной железы человека сформировался на почках мыши, путем проверки специфической экспрессии ПСА у человека.

Хотя этот метод может дать представление о функции предстательной железы и начале заболевания, он также может быть применен к другим системам, таким как ксенотрансплантат опухолей предстательной железы человека и индукция еженедельных линий опухолевых клеток для формирования опухолей. После усыпления беременной мыши или крысы и изоляции эмбрионов отделите их от амниотического мешка, перережьте пуповину и перенесите в 50-миллилитровую трубку, содержащую ледяные мушки. Сбалансируйте солевой раствор и держите на льду.

Поместите эмбрион в 100-миллиметровую чашку Петри и с помощью ножниц рассеките его пополам на уровне комка. Удалите желудок и тонкую кишку, а затем найдите яичники у женского эмбриона, которые находятся на полюсах почки или яички у самца, расположенные на уровне мочевого пузыря. В области вскрытия.

С помощью ножниц Venice разрежьте брюшную стенку, чтобы обнажить мочевой пузырь и заднюю стенку брюшной полости. Освободите верхние половые пути от прикреплений и освободите пуповину. Разрежьте лобковую кость и с помощью Дюмона тонким наконечником щипц.

Тупым образом отделите его от передней стенки урогенитальной пазухи. Отделите заднюю стенку урогенитального синуса от прямой кишки и разрежьте урогенитальный синус с мочевым пузырем на нижнем конце. Затем отделите мочевой пузырь от урогенитального синуса.

Храните мочеполовой пазуху и закупорку в ледяном HBSS. Перенесите урогенитальный синус в 50-миллилитровую трубку, содержащую 1% трипсина в HBSS без кальция и магния, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После инкубации удалите трипсин и добавьте 10% FBS и среду DM A MF 12 для нейтрализации пищеварения.

Далее с помощью иглы или щипцов с тонким концом тщательно подразните липкий мезенхимальный рукав от эпителиальной трубки. Сохранение эпителиальной трубки в целости и сохранности снижает вероятность контаминации мезенхимы эпителиальными клетками. Это может привести к образованию желез грызунов вместе со стволовыми клетками, полученным из железистого эпителия человека.

Перенесите UGSM в новую 50-миллилитровую пробирку, содержащую среду DMM F 12, содержащую 10% FBS, 1% стрептококка, 1% заменимых аминокислот и один наномоляр. R 1 8 81 Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2 в течение ночи. На следующий день центрифугируйте ткань при 200 G. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте PBS для промывания гранулы.

После удаления PBS ресуспендировать ткань в 0,2%-ной коллагеназе в D-M-A-M-F 12 и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия при легком покачивании в течение одного часа, энергично перемешать ткань пищеварения три раза, пока она не станет однородной одноклеточной смесью, и нейтрализовать коллагеназу путем добавления среды D-M-A-M-F 12 с 10%FBS 1%-пен-стрептококком, 1% заменимых аминокислот и одним наномоляром R 1 8 81. Промойте элементы три раза, гранулировав их при 200 G, и суспензию в HBSS. Наконец, восстановите, приостановите мезенхимальные клетки в DMM F 12 и используйте гемоцитометр для их подсчета для проведения трансплантации.

После подготовки стерильной операционной области и обезболивания самца атимической обнаженной мыши с помощью инъекции кетамина ксилазина, согласно текстовому протоколу, выполните щипкование пальцев ноги для подтверждения уровня седации. Хирургически подготовьте мышь, побрив место операции при необходимости и очистив его тремя чередующимися салфетками с 70% содержанием спирта с последующим нанесением раствора бетадина. После нанесения глазной мази сделайте продольный разрез в один сантиметр на спине и продолжайте резать брюшную стенку продольным разрезом в 0,5 сантиметра. Аккуратно выдавите почку из брюшной полости и используйте капли стерильного физиологического раствора, чтобы сохранить ее влажной.

Затем с помощью иглы шприца 27 калибра аккуратно проколите почечную капсулу, чтобы создать место для инъекции клеточной смеси. Затем наполните иглу шприца 28 калибра 10 микролитрами клеточной смеси и медленно введите ее в место прокола, проникая в паренхиму почки. Чтобы добраться до области под почечной капсулой.

Введите 10 микролитров клеточной смеси, чтобы сформировать комок на почке под почечной капсулой, и извлеките иглу. Верните почку в брюшную полость и закрепите мышечный слой брюшины четырьмя нейлоновыми швами. Закройте кожу швами или скобами и используйте стерильный физиологический раствор для удаления крови с кожи.

Здесь показано ультразвуковое изображение растущего ксенотрансплантата через восемь недель после имплантации. Обведенная область представляет собой ксенотрансплантат на поверхности почки. Эти изображения демонстрируют рост ксенотрансплантата на поверхности почки.

Через 12 недель из человеческих ЭС-клеток, имплантированных в отсутствие урогенитального синуса, мезенхима образует большие тератомы, в то время как самостоятельно имплантированная мезенхима урогенитального синуса не образует какой-либо различимой структуры. Показано в центре. На этом рисунке представлены репрезентативные иммуногистохимические окрашивания эпителия предстательной железы человека, полученного из стволовых клеток, в сравнении с тканями предстательной железы взрослого человека.

Как показано здесь слева, железы содержат положительный AR-положительный слой люминального эпителия. Это также ПСА-положительный, P 63-положительный слой базальных эпителиальных клеток и редкий хромогранин. Являясь нейроэндокринными клетками, железы не являются раковыми, о чем свидетельствует отрицательное окрашивание A-M-A-C-R при кастрации хозяина.

Положительные люминальные клетки AR PSA больше не присутствуют, демонстрируя характерную андрогенную зависимость. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о большой осторожности при отделении мезенхимы урогенитального синуса от эпителия. По мере загрязнения урогенитального синуса эпителий образует железы и может исказить ваши результаты.