Высокая пропускная метод измерения скорости клубочковой фильтрации в сознании Мыши

Общая цель этой процедуры — показать другим исследователям, как определить функцию почек у бодрствующих мышей. Это достигается путем предварительного диализа, флуоресцеина изотиоцианата или инулина FSE в течение 24 часов и определения его концентрации для инъекций. Второй шаг — взвесить мышь, подготовить точные объемы фитзи инулина для ретробульбарной инъекции и обезболить мышь.

Затем проводится инъекция инулина Retrobulbar Fitzy и в течение 75 минут берется восемь образцов крови. Последним шагом является измерение Fitz Nulin с помощью микрообъемного флуороспектрометра и расчет функции почек с использованием двухфазной модели экспоненциального распада. В конечном счете, сочетание чувствительности метода одиночной болюсной инъекции Fiti Nulin с микрообъемными возможностями флюороспектрометра позволяет обнаруживать различия в функции почек, вызванные генетическими модификациями у мышей, изменениями в рационе питания или применением лекарств.

Основные преимущества этой методики перед существующими методами, такими как непрерывная инфузия и обезболивание, имплантация осмотических мини-насосов с использованием радиоактивного инулина, заключаются в том, что хирургическое вмешательство не требуется. Это не окончательный эксперимент. Мочу не нужно собирать, и можно измерить до 24 М в день.

Я продемонстрирую эту процедуру вместе с Марией Азимо, научным сотрудником из моей лаборатории Для приготовления раствора для инъекций Fitzy Нулин. Взвесьте достаточно инулина ЗИ на два миллилитра 5%-ного раствора, растворите меченый инулин в 0,85%-ном растворе хлорида натрия путем нагревания до 90 градусов Цельсия до полного растворения. Поместите кусок диализной мембраны диаметром 20 см в двойную дистиллированную воду на 30 минут, чтобы удалить остатки натриевой кислоты с мембраны, после этого промойте мембрану несколько раз, заполните диализную мембрану растворенным инулином Fitzy как следует с помощью крышек, а затем взвесьте всю мембрану.

Дайте растворенному инулину Фитзи понервироваться в одном литре 0,85% раствора натрия хлорида и медленно перемешайте в защищенном от света месте в течение 24 часов при комнатной температуре после диализа, снова взвесьте всю диализную мембрану и рассчитайте новую концентрацию. Вода будет осмотически перемещаться в мембрану, а несвязанный FSI будет выходить из мембраны. Таким образом, концентрация инулина FSI существенно снизится.

Рассчитайте новую подходящую концентрацию инулина по следующей формуле, где C — новая концентрация. N — это исходное подходящее количество инулина E, а V — новый объем, который представляет собой разницу в весе диализной трубки до и после диализа, а также объем исходного раствора инулина fitzy. Далее стерилизуют диализованный раствор путем фильтрации через шприцевой фильтр 0,22 мкм.

Не забывайте всегда защищать инулин Fitzy от света, чтобы избежать фотообесцвечивания перед экспериментом. Измеряйте массу тела мышей после кратковременной анестезии от 4 до 5% фтора по ISO от 4 до 5%. Проверьте глубину анестезии с помощью рефлекторной аспирации двух микролитров на грамм массы тела диализованного фитзи нулина с помощью шприца Hamilton объемом 100 микролитров с иглой 26 калибра длиной полдюйма для удаления пузырьков воздуха, затем переключитесь на иглу длиной полдюйма 30 калибра для инъекции.

Приступайте к введению диализованного инулина фитзи в ретроорбитальное сплетение. Позвольте мышам самопроизвольно восстановиться в их домашней клетке. Один миллиметр мышиного хвоста один раз приложите ножницами и соберите кровь в несколько временных точек после инъекции в мини-капилляры гепарина натрия.

Запечатайте мини-капилляры после забора крови с помощью пломбы cha seal и храните образцы в защищенном от света месте. Поместите запечатанные мини-капилляры внутрь капилляров гематокрита и центрифугируйте в течение пяти минут после центрифугирования. Разбейте мини-капилляры с помощью алмазного резака и перенесите всю плазму путем пипетирования в пробирку объемом 0,2 миллилитра.

Сделайте разведение один к 10, используя два микролитра плазмы и 18 микролитров 0,5 моля на литр кучи в новой пробирке объемом 0,2 миллилитра. Затем отмерьте два микролитра разбавленного образца с помощью NanoDrop 3, 300 в двух экземплярах для высокой производительности шести мышей. Пожалуйста, следуйте протоколу блок-схемы, представленному в текстовом протоколе, чтобы измерить СКФ всей почки методом однократной болюсной инъекции: необходимо собрать восемь образцов крови через 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 и через 75 минут после инъекции нулина FSE.

На этой блок-схеме цифры обозначают точки времени сбора, в то время как цифры в скобках обозначают количество образцов, а точки времени слева от вертикальной красной линии указывают на точки времени инъекции. Каждая мышь помечена разным цветом. Чтобы получить последовательные заборы крови, следуйте стрелкам.

Серыми прямоугольниками указано, когда следующая мышь должна быть подготовлена к изофторсодержащей анестезии перед инъекцией с использованием этого протокола. Минимальное время между двумя заборами крови у разных мышей составляет одну минуту разбавленного раствора для инъекций нулина Фитзи с разбавленной плазмой мыши, чтобы получить стандартные разведения, указанные в текстовом протоколе. Концентрация норм будет зависеть от проводимого диализа и всегда будет разной для каждого препарата ФСИ нулин.

Поэтому необходимо каждый раз вводить концентрацию для стандартной кривой. Анализируйте данные для расчета скорости клубочковой фильтрации или СКФ с помощью соответствующего программного обеспечения с использованием двухфазной экспоненциальной функции распада, как подробно описано в текстовом протоколе для измерения СКФ у мышей, находящихся в сознании. Кинетика инулина в плазме после однократного внутривенного введения используется для расчета GFRA двухкамерной модели.

Начальная фаза быстрого распада представляет собой перераспределение фитзи инулина из внутрисосудистого компартмента во внеклеточную жидкость. Более поздняя фаза с более медленным распадом концентрации физи инулина преимущественно отражает системный клиренс из плазмы. Сахарный диабет первого типа был индуцирован внутрибрюшинным введением стрептозотоцина.

СКФ определяли до и через пять недель после индукции диабета первого типа, у животных с диабетом первого типа отчетливо наблюдалась клубочковая гиперфильтрация. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как измерить СКФ у больших мышей с помощью техники одиночной болюсной инъекции и двухфазной экспоненциальной модели DK.