Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы выделить моноциты из периферической крови человека и дифференцировать их в сторону различных типов поляризации макрофагов. Это достигается путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека методом центрифугирования с градиентом плотности. В качестве второго этапа проводится выделение отрицательных гранул с получением чистых CD 14 положительных моноцитов.

Затем моноциты культивируются в определенных условиях, чтобы индуцировать специфически поляризованные макрофаги. В конечном счете, дифференциальная экспрессия маркеров поляризации макрофагов в ответ на условия их культивирования может быть определена с помощью количественной ПЦР. Этот метод может помочь препарировать дифференциацию макрофагов в сторону различных типов поляризации.

Особенность, которая крайне важна при воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. После забора 30 миллилитров цельной крови из вены предплечья у добровольца, равномерно разделите кровь на две неполистирольные 50-миллилитровые конические трубки. Затем разведите кровь в каждой пробирке с 10 миллилитрами PBS.

Затем добавьте 25 миллилитров гистопакета к 25 миллилитрам цельной крови и PBS в каждой пробирке, следя за тем, чтобы гистопакет и кровь не смешивались. Затем центрифугируйте пробирки в течение 30 минут при давлении 400 G и комнатной температуре без перерыва. После спина сначала отсасывайте слой плазмы, а затем переносите непрозрачный слой границы раздела в свежую 50-миллилитровую трубку.

Промойте ячейки от границы раздела в 20 миллилитрах PBS плюс CDTA в течение пяти минут при 250 G и четырех градусах Цельсия. Затем, выбросив надосадочную жидкость, суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах PBS плюс CDTA и хорошо перемешайте клетки путем вортекса в течение 10 секунд. Теперь разведите 200 микролитров клеточной суспензии в 300 микролитрах PBS плюс ЭДТА, и 500 микролитрах триамного синего.

Чтобы получить от 200 до 500 клеток на 10 квадратов и гемоцитометра, начните отрицательную изоляцию, вращая клетки три раза в течение 10 минут при 120 G. После второй промывки мы суспензируем гранулу в девяти миллилитрах стерильной воды в течение трех секунд. Затем добавьте один миллилитр из 10 XPBS после промывки и подсчета клеток еще раз, разведите их в легко устанавливаемом буфере в соотношении пять раз по 10 из семи клеток на миллилитр. Теперь инкубируйте клетки в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в 50 микролитрах на миллилитр коктейля для обогащения моноцитов.

В течение последней минуты инкубационного вихря гранулы обогащения моноцитов в течение 30 секунд. Затем добавьте в клетки 50 микролитров на миллилитр бусин и выдержите бусину в клеточной суспензии еще пять минут. После второй инкубации доведите объем клеточного раствора до 2,5 миллилитров.

При большем буфере eep раствор теперь будет иметь коричневатый цвет. Далее поместите трубку в магнит EEP на две с половиной минуты при комнатной температуре. После того, как связанные с шариками клетки успеют прилипнуть, вылейте буфер, содержащий несвязывающиеся моноциты, в свежую стерильную пробирку.

Теперь раствор будет иметь белесый цвет после однократной промывки несвязанных клеток PBS плюс EDTA, переноса клеток в многолуночный планшет, затем добавления одного миллилитра питательной среды в расчете на один умножить на 10 к шести клеткам на культуральную пластину. Наконец, культивируйте клетки в интересующих нас экспериментальных условиях в течение шести дней, чтобы индуцировать дифференцировку макрофагов. Замените половину среды через три дня на свежую через шесть дней.

Соберите клетки для нужного экспериментального анализа. Используя описанный выше протокол, примерно в 25 случаях 10 из шести моноцитов обычно получают из 100 миллилитров крови; чистота моноцитов, определяемая с помощью проточного цитометрического окрашивания, для CD 14 обычно превышает 95% при первом добавлении в культуру. Моноциты изначально имеют круглую форму и плавают в течение нескольких часов.

Тем не менее, они прилипают, придавая им вид жареного яйца или веретена через шесть дней. В культуре с монокультивированием MCSF или с добавлением окисленного ЛПНП в течение последних 24 часов, или примерно 80% клеток, не подвергавшихся воздействию окисленного ЛПНП, являются жизнеспособными, что определяется по йодиду пропидия. С другой стороны, окрашивание окисленными ЛПНП приводит к примерно 70% жизнеспособности клеток после шести дней культивирования.

Цитометрический анализ показывает, что, хотя клетки продолжают экспрессировать лейкоцитарный маркер CD 45 ro, они подавляют моноцитарный маркер CD 14. В зависимости от конкретных условий, которые могут индуцировать поляризацию макрофагов во время культивирования клеток, необходимы дополнительные маркеры, чтобы гарантировать успешную поляризацию. Определенные условия могут индуцировать поляризацию макрофагов.

Например, поляризованные макрофаги M1 экспрессируют типичные маркеры, такие как IL six и TNF alpha, в то время как M два поляризованных макрофага экспрессируют CD 36 и CD 2 0 6, макрофаги могут быть дополнительно изучены в функциональных экспериментах. Например, поглощение окисленных ЛПНП можно изучить с помощью флуоресцентно меченых ЛПНП. В этом эксперименте клетки подвергались воздействию 10 микрограммов на миллилитр окисленного ЛПНП, меченного DII, в течение четырех часов, после чего ядра окрашивались с помощью dpi.

Гистограмма демонстрирует проточное цитометрическое измерение поглощения окисленных DII ЛПНП макрофагами, индуцированными MCSF, при этом сплошная серая гистограмма представляет необработанные контрольные клетки, а черная открытая гистограмма отображается. Представляет собой окисленные макрофаги, обработанные ЛПНП после его развития. Этот метод позволяет исследователям изучать дифференцировку и гетерогенность макрофагов человека.

Таким образом, это позволяет им изучать воспалительные заболевания, такие как атеросклероз, для выявления новых механизмов заболевания и новых терапевтических мишеней.