Высокая пропускная способность, автоматизированное извлечение ДНК и РНК из клинических образцов TruTip использованием технологий на общей жидкостной обработки Роботы

Общая цель следующего эксперимента заключается в выделении геномной ДНК человека из цельной крови с использованием технологии экстракции на специализированных наконечниках (true tip) на рабочей станции для работы с жидкостями Hamilton Star. Для достижения этой цели клетки лизируют в растворе, состоящем из буфера для лизиса образца крови, протеиназы K и этанола; смесь аспирируют и дозируют через наконечники true tip несколько раз, обеспечивая связывание ДНК с матрицей наконечника. Затем через наконечники true tip пропускают два разных промывочных буфера для удаления остаточных белков, лизирующего буфера и других загрязнений из связанных нуклеиновых кислот.

На третьем этапе связывающая матрица истинного наконечника высушивается путем многократного аспирирования и подачи воздуха для испарения остатков промывочного буфера. Затем через связывающую матрицу несколько раз пропускают элюирующий буфер для высвобождения ДНК из матрицы. Благодаря технологии истинных наконечников таким образом экстрагируется геномная ДНК высокой молекулярной массы, не содержащая загрязнений, что может быть подтверждено методом УФ-видимой абсорбции, гель-электрофорезом, количественной ПЦР или секвенированием. Преимуществом истинных наконечников перед другими методами подготовки проб, основанными на спиновых колонках или магнитных частицах, является простота автоматизации использования истинных наконечников.

Метод не требует дорогостоящих систем с центрифугами и магнитными стержнями, а упрощенный рабочий процесс позволяет сэкономить ценное место на рабочем столе. Хотя сегодня мы сосредоточимся на цельной крови, Tru Tip может быть применен и для других образцов геномной ДНК, а также для вирусной РНК из клинических мазков или выделения внеклеточной ДНК из плазмы, чтобы назвать несколько примеров. Процедуру продемонстрирует Дейн Брэди, инженер по автоматизации нашей лаборатории, который принимал активное участие в разработке метода экстракции Tru Tip на рабочей станции по переливанию жидкостей Hamilton.

В данном протоколе робот для работы с жидкостями Hamilton Star одновременно экстрагирует ДНК из 96 лунок с цельной кровью. Робот Hamilton Star оснащен дополнительным блоком термошейкера на платформе, который необходим для ферментативного переваривания некоторых клинических матриц, таких как цельная кровь. Поскольку система может быть оснащена 96-канальной пипеточной головкой, для каждого этапа с использованием наконечников и для реагентов предусмотрен отдельный 96-луночный планшет.

Сначала включите вспомогательное оборудование робота Hamilton Star и компьютер. Запустите программное обеспечение Hamilton Run Control. Откройте файл запуска для 96 образцов, предоставленный ACON.

Теперь настройте расположение деки Star в соответствии со схемой. В все позиции, отмеченные цифрой один, поместите фильтрующие наконечники объемом 1 мл; в позицию два — нефильтрующие наконечники объемом 1 мл; в позицию три — наконечники Conni Hamilton LPT объемом 1 мл и длиной 2 мм. Продолжайте сверяться с таблицей, чтобы заполнить остальные позиции с 5 по 12 необходимыми лабораторными принадлежностями, но пока не загружайте образцы.

Теперь разлейте реагенты: по 75 мл буфера для лизиса и связывания. Буфер F следует поместить в позицию кюветы пять. В качестве альтернативы для оптимизации подготовки и упрощения схемы расположения на платформе можно использовать планшеты, предварительно заполненные буферами.

Продолжайте соответствующую загрузку робота. В завершение снимите колпачки с пробирок с кровью и поместите их в штативы для образцов или в позицию четыре платформы. Поместите образец 1 в заднюю часть крайнего левого штатива и последовательно заполняйте каждый штатив, пока образец 96 не окажется в передней правой позиции.

После загрузки всех образцов дайте им уравновеситься при комнатной температуре. Поскольку протокол полностью автоматизирован, вероятность ошибки оператора минимальна. Образцы должны быть размещены в штативе в правильном порядке, однако для обеспечения надлежащего отслеживания образцов может быть внедрена система штрихкодирования.

Чтобы запустить автоматический скрипт, нажмите кнопку воспроизведения в верхнем левом углу окна файла запуска и введите количество обрабатываемых образцов. Первым шагом скрипта является перенос 80 µL протеиназы K в инкубационную планшетку, расположенную в позиции 14 на модуле термошейкера. Затем скрипт с помощью восьмиканального манипулятора дозирует по 200 µL образца в каждую лунку инкубационной планшетки.

Затем с помощью 96-канальной головки в каждую лунку инкубационной планшеты разносится по 600 µL лизирующего буфера F. Далее по скрипту раствор перемешивается в течение 10 циклов и инкубируется в планшете с глубокими лунками в течение 20 минут при 70 °C и 500 RPM; температура составляет 60 °C, что находится в пределах диапазона активности протеиназы K. Пока образцы инкубируются, система обработки жидкостей продолжает работу, разнося реагенты для экстракции и элюции из общих кюветок в соответствующие 96-луночные планшеты; в каждую лунку планшета с глубокими лунками добавляется по 100 µL элюирующего буфера A.

В позицию 13 в каждую лунку глубокого планшета дозируют 800 microliters этанола. В позицию 10 в каждую лунку глубокого планшета в позиции 12 добавляют 1.6 milliliters промывочного буфера K, а в каждую лунку глубокого планшета в позиции 11 добавляют 1.6 milliliters промывочного буфера J. После 20-минутной инкубации смесь образцов переносят из планшета для инкубации в глубокий планшет с этанолом в позицию 10, где ее перемешивают путем 12 циклов пипетирования.

На протяжении всего процесса наконечники для реагентов сбрасываются в контейнер для отходов по мере необходимости. Программа переходит от этапа лизиса к экстракции ДНК, предварительно загружая 96 основных наконечников из позиции три на платформе. Следующий шаг заключается в аспирации и дозировании образцов в позиции 10 в течение 10 циклов, что обеспечивает связывание нуклеиновых кислот с монолитом основного наконечника.

Затем наконечники перемещаются в позицию 11, где промывочный буфер J циркулирует через монолит пять раз для удаления остатков лизирующего агента, буфера и матрикса образца. Затем наконечники перемещаются в позицию 12, где промывочный буфер K циркулирует через них пять раз для удаления белков и других загрязнений из связанных нуклеиновых кислот. После этого наконечники высушиваются на воздухе путем 80-кратного циклического перемещения на высокой скорости над планшетом для промывки.

Теперь наконечники перемещаются в позицию 13, где элюирующий буфер дважды проходит через них пять раз, высвобождая ДНК в планшет с глубокими лунками. Затем наконечники сбрасываются в контейнер для отходов. На этом работа программы завершена.

Извлеките элюционную планшету из прибора и перенесите экстрагированные образцы в соответствующие пробирки для хранения или дальнейшего использования. Программу также можно настроить для автоматического переноса конечных образцов в выбранные пробирки или планшеты всего за один час. С помощью робота автоматизированная система экстрагировала геномную ДНК из 96 образцов крови.

Профили абсорбции 45 положительных образцов крови обрабатывались одновременно с 45 холостыми пробами реагента. Среднее соотношение абсорбции на 260 и 280 нм составило 1,96, а среднее соотношение на 260 и 230 нм — 1,93, что указывает на чистоту образцов на 1% агарозном геле. Случайные образцы характеризовались высоким молекулярным весом при минимальном сдвиге.

Средний выход составил около 5 µg ДНК на 200 µL цельной крови. При оптимизации автоматизированного протокола с использованием наконечников True Tip особое внимание уделяется предотвращению перекрестного загрязнения между лунками. ПЦР в реальном времени демонстрирует четкое разделение положительных и отрицательных образцов, как показано здесь.

Экстракцию РНК для 96 образцов можно полностью завершить менее чем за один час при минимальном участии оператора. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать геномную ДНК человека из цельной крови с помощью технологии TRU Technology Automated на рабочей станции для работы с жидкостями Hamilton Star.