В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы использовать генетически кодированные флюорочетверы для измерения динамики кальция в отдельных нейронах червя-нематоды. См. элегантность, это достигается путем установки и демобилизации неповрежденных C элегантности, экспрессирующих чувствительный к кальцию флуорофор в исследуемых нейронах на стандартном предметном стекле микроскопа. Затем отдельные нейроны визуализируются in vivo с помощью видеомикроскопии и стандартных методов эпифлуоресцентной визуализации.

Затем видео анализируется для измерения интенсивности флуоресценции в определенных местах нейрона для двух часто используемых Fluor fours G camp, что дает устойчивый одноканальный сигнал большой амплитуды и хамелеон на основе ладов, который генерирует двухканальное отношение. Результаты метрических измерений представляют собой проявленную активность нейронов в ответ на определенные сенсорные стимулы, а также физиологию клеточного кальция в ответ на повреждение клеток, оба из которых основаны на оптическом измерении относительных уровней кальция в визуализируемом нейроне. Основные преимущества этого метода по сравнению с аналогичными методами в системах позвоночных или традиционной электрофизиологии заключаются в том, что CL elgan представляет собой надежную, гибкую и генетически управляемую систему для визуализации нейронов in vivo, которая является технически простой и экономически эффективной.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в широком спектре биологии нейронов, позволяя измерять как активность, так и синусоиду отдельных нейронов in vivo. Начните со стандартного составного микроскопа с возможностями эпифлуоресцентной визуализации для наилучшего качества изображения и сигнала. Используйте объектив с большим увеличением, высокой числовой апертурой и высокочувствительную охлаждаемую ПЗС-камеру, чтобы максимизировать разрешение и чувствительность изображения, сводя к минимуму фоновый шум для одноцветных четверок флоры.

Используйте стандартный набор флуоресцентных фильтров для микроскопа, предназначенный для конкретной длины волны Fluor four для лагеря G. Используйте стандартный набор фильтров GFP, оптимизированный для возбуждения на 488 нм и излучения на 525 нм, четыре отношения метрических флор, четыре четверки, такие как хамелеон, используйте двойную систему визуализации, чтобы идентичные изображения могли быть одновременно получены на двух разных длинах волн. Это может быть достигнуто с помощью коммерчески доступной или домашней системы, которая проецирует два изображения на камеру следующим образом.

Комплект фильтров микроскопа с фильтром возбуждения 440 плюс-минус 20 нм и длинном проходом 455 нм и зеркальным отражением изображения, размещенный в начальной плоскости изображения непосредственно за портом изображения микроскопа, где обычно находится ПЗС-сенсор камеры, первый комплект релейных линз, удаленный на одно фокусное расстояние от исходной плоскости изображения, чтобы он сопоставлял свет. Дихроичное зеркало, которое разделяет свет на две отдельные длины волн изображения или каналы, отражающие один цвет и пропускающие другие эмиссионные фильтры. Дальнейшее ограничение проходящего света до определенных длин волн изображения. Вторые релейные линзы, по одной для каждого канала, размещены на путях луча таким образом, что они перефокусируют свет на вторую плоскость изображения на ПЗС-камере.

Пара зеркал и второе дихроичное зеркало направляют траектории луча таким образом, что два изображения рекомбинируются и проецируются бок о бок на камеру. ПЗС-сенсор. Вот пример полученного изображения.

После настройки изображения можно отрегулировать и точно настроить следующим образом: переместите положение камеры таким образом, чтобы передаваемое изображение покрывало половину поля зрения камеры. Переместите отраженное изображение, чтобы оно охватывало вторую половину поля зрения, настроив последние два зеркала на пути луча, и оптимизируйте фокусировку, перемещая вторую релейную линзу для каждого канала вперед и назад по траектории луча. Приобретайте животных, экспрессирующих чувствительный к кальцию флуорофор в интересующем нейроне, из генетического центра Citis или из других источников.

В качестве альтернативы можно конструировать трансгенных животных, используя стандартные методы тюленя-эльгана. Затем используйте один из следующих методов для иммобилизации элегантности уплотнения для фармакологического паралича при 0,05% от 0,05% до 2% и сделайте прокладки для визуализации, надавливая каплю расплавленного ароса между двумя стеклянными предметными стеклами, которые имеют два куска лабораторной ленты в качестве прокладок. Сняв верхнюю горку, выберите от пяти до 10 животных и перенесите их на площадку.

Накройте подушечку покровным листом и нанесите на углы небольшое количество горячей смеси парафина и вазелина в соотношении один к одному, чтобы удержать ее в нужном положении. Подождите от пяти до 10 минут, чтобы лемизол подействовал и животные полностью замерли. Чтобы обездвижить животных методом жесткого ароса, изготовьте 10%-ные подушечки.

Добавьте около трех микролитров раствора микросферы полистирола от одного до 10 на поверхность подушечек и быстро соберите от пяти до 10 чистых морских элегантностей в лужу свекольного раствора. Аккуратно накройте чехлом и нанесите расплавленный воск на углы. Типичные эксперименты требуют введения определенного стимула или состояния животному во время видеозаписи реакции одного нейрона.

Для получения видео. Мы часто получаем изображения со скоростью около одного кадра в секунду с выдержкой около 300 миллисекунд. Видео должно быть проанализировано для измерения интенсивности флуоресценции для каждого кадра в пределах интересующей области или ROI отображаемого нейрона относительно ближайшей фоновой области.

Наша программа анализа отображает сжатое изображение всех изображений в фильме, из которого вручную выбирается грубая граница, охватывающая интересующий объект на всех кадрах, и выбирается независимая область фона. В первом случае ROI выбирается вручную в пределах области границы. Для каждого последующего кадра программа выбирает самые яркие пиксели в пределах граничной области, чтобы сгенерировать ROI правильного размера для изображений метрики соотношения, сгенерированных с помощью хамелеона, выбирает аналогичный грубый ROI и область фона для каждого из двойных изображений или каналов, а затем ROI от одного изображения на первом кадре. флуоресцентный сигнал F для каждого кадра рассчитывается как средняя интенсивность пикселей в ROI за вычетом средней интенсивности в фоновой области.

Относительный уровень кальция для каждого кадра рассчитывается как процентное изменение интенсивности, нормализованное до начального базового значения, измеренного из первого кадра или серии кадров. Значения метрики отношения вычисляются как отношение двух каналов. ROI, выбранный в теле клетки, генерирует самые сильные и устойчивые сигналы, но также можно выбрать и измерить сигналы ROI вдоль нервных отростков.

Воздействие возбуждающего света может вызвать обесцвечивание флоры и характеризуется устойчивым снижением сигнала, которое зависит от уровня воздействия, если происходит обесцвечивание. Сократите время экспозиции и/или интенсивность возбуждения с помощью фильтров нейтральной плотности, чтобы свести к минимуму шум, создаваемый из-за элегантного движения моря во время записи. В ответ на воздействие света и экспериментальные раздражители тщательно выполняйте процедуры иммобилизации с использованием чистых препаратов.

Для успешного анализа изображения выбирайте области фона, которые достаточно однородны, темнее, чем изображение для нейронов, и достаточно удалены, чтобы избежать рассеянного света. Здесь показан один С-элеганс, нейрон SJ, экспрессирующий G-лагерь, реагирующий на внешнее электрическое поле в три вольта на сантиметр в течение трех отдельных попыток, каждая из которых длится 10 секунд. Животное было обездвижено с помощью лемизола, но на видео видны небольшие недостатки как движения, так и концентрации.

Измеряли интенсивность дрейфовой флуоресценции на теле клетки. Сигнал устойчивый, несмотря на видеодефекты, показывающие значительное увеличение флуоресценции (около 250%) в ответ на первый и третий стимулы. Результат от второго раздражителя существенно снижается.

Демонстрируя вариабельность в нейронном ответе, обесцвечивание минимально, о чем свидетельствует возврат к постоянному исходному уровню. Травматическое повреждение клеток запускает большой переходный процесс кальция внутри нейрона, который играет важную роль в физиологической реакции клетки. На этом видео показана реакция на лазерную содомию одного нейрона.

Двойная оптика изображения была использована для регистрации сигналов от флуоресцентных каналов CFP и YFP репортера-хамелеона. На этом рисунке показан результирующий сигнал лада, измеренный на теле клетки в ходе эксперимента с лазерной хирургией. В ответ на лазерное повреждение и повышение цитоплазматического кальция при Т равно нулю секунд.

CFP быстро уменьшается, а YFP увеличивается, что приводит к немедленному увеличению сигнала метрики отношения примерно на 200%, который поддерживается в течение примерно 90 секунд, прежде чем вернуться к почти базовому уровню. Обесцвечивание минимально, о чем свидетельствует постоянный базовый уровень. На этом рисунке показан результирующий сигнал лада, измеренный в сегменте аксона, близком к точке реза.

Локальное количество флюорозавра-4 меняется в течение эксперимента. Усложняя сигнал, лазерная хирургия разрывает аксон и кратковременно разрывает мембрану, позволяя четвертой флоре ускользнуть и временно снижая ее локальную цитоплазматическую концентрацию. Это видно по первоначальному уменьшению кривой YFP в более поздние временные точки.

Отрезанный конец набухает в рамках его продолжающегося восстановления, что приводит к более локализованному флюорооксиду и увеличению интенсивности. Это наиболее очевидно в медленно увеличивающейся трассе CFP, однако эти изменения влияют на оба канала в равной степени, и отношение ладов эффективно компенсирует это, давая устойчивый сигнал. Полученное в результате измерения показывает реакцию, аналогичную реакции тела клетки, с немедленным увеличением сигнала примерно на 150%, резким восстановлением до почти исходного уровня примерно через 90 секунд, а затем дополнительным меньшим вторичным ответом примерно через 150 секунд.

Доступны коммерческие микроскопы для пропорциональной метрической визуализации, а также более сложное программное обеспечение для анализа изображений, которое генерирует попиксельные метрические измерения отношения После освоения эти методы могут быть выполнены с относительной легкостью и без сложных методов подготовки образцов, препарирования тканей или визуализации, требуемых другими модельными системами или методами. Целые эксперименты могут быть проведены за час или два, если они выполнены правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как обездвижить элегантность для визуализации, выполнить максимальное копирование видео на отдельных нейронах in vivo и проанализировать полученное видео для измерения относительных уровней кальция на основе нейрона.