Выделение Родные почвенных микроорганизмов с потенциалом для Breaking Down биоразлагаемых пластиковых Фильмы Мульча используется в сельском хозяйстве

Общая цель следующего эксперимента заключается в выделении почвенных грибков и бактерий, которые колонизируют и разлагают биоразлагаемые пленки для мульчи. Это достигается путем первичной инкубации биоразлагаемых мульчирующих пленок в сетчатых мешках в почве на время, достаточное для того, чтобы обеспечить значительную колонизацию местными почвенными микробами. После инкубации мульча извлекается и разбавляется, в результате чего образуются отдельные изолированные колонии каждого культивируемого типа тесно связанных микробов.

Затем изолированные микробы наносятся на свежую поверхность, дезинфицированные, биоразлагаемые мульчи, а также на агаровые плиты с источником углерода или без него. Чтобы сравнить рост, результаты затем подтверждаются в жидкой среде. Результаты показывают колонизацию и/или деградацию определенными изолятами на основе сканирующей электронной микроскопии и могут быть проверены с помощью гель-проникающей хроматографии.

Не забывайте, что работа с неопознанными грибковыми и бактериальными изолятами может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, герметизация пробирок и посуды для культивирования, а также работа в шкафу биобезопасности. После инкубации кусочков мульчи в почве и подготовки сред и реагентов в соответствии с текстовым протоколом нарежьте новые кусочки мульчи на квадраты по 4,25 сантиметра для обеззараживания кусочков мульчи. Автоклавируйте их, если это не изменит или не испортит их для неавтоклавируемых частей мульчи, например, изготовленных из пластика.

После подготовки шкафа биобезопасности в соответствии с текстовым протоколом поместите кусочки мульчи в обеззараженный капюшон рядами и инкубируйте кусочки мульчи под ультрафиолетовым светом в течение двух часов, используя чистые стерилизованные щипцы и, начиная с переднего ряда и двигаясь к заднему, чтобы не класть руки на только что обеззараженные поверхности. Переверните кусочки мульчи, положив зараженную стороной вниз на чистый участок, подверженный воздействию ультрафиолетового излучения, но ранее не контактировавший с мульчей. После двух часов УФ-обработки с каждой стороны, снова работая спереди назад.

С помощью стерильных щипцов удалите кусочки мульчи из шкафа биобезопасности и поместите их в стерильные сухие контейнеры, такие как стаканы, покрытые фольгой. Храните их при комнатной температуре в темноте под стерильным капюшоном. Используя асептическую технику, положите загрязненные ультрафиолетом кусочки мульчи на поверхность агаровых пластин, сначала аккуратно опустив один угол, позволяя оставшейся части квадрата соприкоснуться с агаром.

Для неводопроницаемых пленок поместите четыре капли по 10 микролитров расплавленной полутвердой среды минимального уровня на углы кусков мульчи, чтобы обеспечить источник воды и питательных веществ для первоначальной колонизации гидрофобных пластиков. Не прикасайтесь к поверхности кусочков мульчи. С помощью наконечника пипетки капли затвердеют в гранулы.

Инкубируйте накрытые пластины в вертикальном положении на ночь при комнатной температуре до застывания. Затем храните пластины агаровой стороной вверх в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. Все материалы, необходимые для биотестов, теперь подготовлены, и вы готовы начать выделение потенциальных грибков, разрушающих мульчу, из кусочков мульчи, которые были закопаны в почву.

Выкопайте из почвы сетчатые мешки и удалите из них кусочки мульчи. Используйте стерильный шпатель и щипцы, чтобы аккуратно удалить излишки почвы с мульчи, не потревожив почву, которая цепляется за поверхность. Разрежьте BDM пленку на квадратные кусочки по одному сантиметру до тех пор, пока не будет восстановлено 0,5 грамма материала.

На каждый тираж переносят образец, по 0,5 грамма мульчи и прикрепляют землю на 25 миллилитров. В пробирки для культур, содержащие 9,5 миллилитров PBS, добавляют 0,5 грамма почвы в почву только в контрольные пробирки или в образцы, где мульча полностью разлагается, чтобы разорвать любые биопленки и отделить клетки от кусочков мульчи. Сделайте трубки вихревыми в течение 30 секунд на высокой скорости, затем обработайте их ультразвуком на водяной бане в течение 10 минут и снова сделайте их вихревыми.

В результате должна получиться однородная суспензия микробных клеток, которые были связаны с кусочками мульчи. Для серийного разведения образцов. Приготовьте одну культуральную пробирку с 4,5 миллилитрами стерильного PBS и заполните три лунки глубокого луночного планшета 450 микролитрами PBS на образец из исходных пробирок с суспензией.

Переведите 0,5 мл в 4,5 мл стерильного PBS для получения 5,0 умножить 10 на отрицательную треть после вортексирования с высокой скоростью в течение 30 секунд, добавьте от 50 до 450 микролитров PBS в 96-луночную смесь с помощью пипетирования осторожно вверх и вниз 10 раз, повторяйте до тех пор, пока не будут завершены разведения до 5,0 умножить на 10 до отрицательных шести. Используйте стерилизованные пламенем изогнутые стеклянные стержни, чтобы равномерно распределить 100 микролитров от каждого из разведений по поверхности агара пластин PDA, содержащих хлорамфеникол, для подавления роста бактерий. Храните тарелки в вертикальном положении в течение 30 минут, чтобы жидкость впиталась.

Затем запечатайте пластины параформом, чтобы избежать утечки спор из неопознанных изолятов. Инкубируйте перевернутые пластины при температуре 20 градусов Цельсия в темноте в течение пяти дней, чтобы как быстрые, так и медленно растущие грибы могли образовать колонии в шкафу биобезопасности. Осмотрите разведение в одиночных изолированных колониях с помощью одной стерильной зубочистки.

Осторожно прикоснитесь к колонии, а затем коснитесь агара грибковой минимальной среды, грибковой минимальной среды плюс пластиковые пластины и пластины с минимальной глюкозой для того, чтобы инокулировать шарики агара поверх пластиковых пленок. Аккуратно потрите зубочисткой поверхность агаровой точки, а затем проведите ею по пластиковой пленке. Повторяйте прививку из той же исходной колонии, пока их не станет четыре.

Повторите полосы на каждой пластине после инкубации пластин при температуре 20 градусов Цельсия в темноте в течение пяти дней. Сравните пластины, чтобы определить изоляты, которые растут на кусочках мульчи лучше, чем на минимальной среде, не содержащей добавленного углерода, кроме агара. Это потенциальные разлагатели мульчи.

Пластина ГММ должна содержать наибольший рост, так как это положительная контрольная пластина, в которой среда содержит глюкозу. Почвенные изоляты могут быть не совсем чистыми на этом этапе, поэтому используйте стерильную зубочистку, чтобы соскоблить инокулюм с грибка, колонизируя мульчу и нанеся ее для изоляции на картофельный агар с декстрозой, затем запечатайте пластину и инкубируйте в течение пяти дней. После пятидневной инкубации возникнут единичные изолированные колонии.

Подтвердите, что эти новые очищенные колонии демонстрируют колонизацию мульчи в биопробе планшета, аналогичную той, которая наблюдается с исходными потенциально нечистыми изолятами. После того, как потенциальные разрушители мульчи были идентифицированы с помощью планшетного биопробы, проверенного с использованием жидкого биоанализа в этом окончательном подтверждающем анализе, даже агар отсутствует под мульчей. Кусочки действительно являются единственным источником углерода для роста микроорганизмов в этой строго подготовленной среде, чтобы начать анализ с поверхности, превращая зараженный кусок мульчи в грибковую среду, в которой отсутствует какой-либо другой добавленный углерод для каждой реплики микробного изолята.

Подготовьте три пробирки для инокуляции. Первая, экспериментальная пробирка с пятью миллилитрами минимальной среды, обозначенной как FMM, содержащая кусок мульчи заданного размера. Во-вторых, отрицательный контроль с пятью миллилитрами минимальной среды без источника углерода.

И в-третьих, положительный контроль с пятью миллилитрами глюкозосодержащей жидкости. Здесь обозначен GMM. Кроме того, подготовьте пробирку с минимальным количеством среды, содержащей каждую тестируемую мульчу, но не инокулируйте ее.

Эта контрольная трубка обнаружит любой рост микроорганизмов в результате загрязнения после выращивания и сбора свежих спор. Согласно текстовому протоколу, в стерильном трансферном колпаке инокулируют заранее подготовленные культуральные пробирки миллионом спор или дрожжевых клеток, запечатывают крышки и инкубируют в темноте без встряхивания при температуре 20 градусов Цельсия. Еженедельно наблюдайте за образцами на предмет роста.

Рост мицелия грибов на кусочках мульчи может быть виден в течение первой недели после инокуляции, особенно по краям кусочков мульчи для планктонных дрожжей Следите за ростом по показаниям оптической плотности на 600 нанометрах, потому что нитчатые грибы, вероятно, прикрепляются непосредственно к кусочкам мульчи. Оцените рост на глаз и подтвердите с помощью световой микроскопии и/или сканирующей электронной микроскопии в минимальном контроле среды. Ищите крошечные белые изгибы, которые слишком малы, чтобы зарегистрировать изменение оптической плотности.

Использование спектрофотометрических методов. Используйте пастерную пипетку для аспирации изгиба и наблюдайте за ними с помощью дифференциальной интерференции. Контрастная микроскопия после выделения трех потенциальных изолятов, разрушающих мульчу в биопробе планшета, как из целлюлозной мульчи под названием Weed Guard plus, которая была нашим положительным контролем, так и из пластиковой мульчи на основе крахмала под названием Biore.

Их инкубировали в жидком биоанализе в течение 68 дней и собирали перед тем, как подвергнуть их сканирующей электронной микроскопии. Как и ожидалось. Грибковые гифи наблюдались на всех образцах, за исключением XX и YY, где палочковидные клетки наблюдались для изолятов на нашей целлюлозной контрольной мульче.

В контрольной группе, как показано здесь, в контрольной группе, инокулированной ООН для защиты от сорняков и мульчи, остаточные трахеи элементов волокон растительного происхождения были обнаружены только в виде легких оспинных отметин, видимых в рядах на некоторых волокнах, хотя грибковые гифи наблюдались во всех трех инокулированных образцах нашей целлюлозной контрольной мульчи. Элементы трахеи были ясно видны только в образцах SS, что позволяет предположить, что расщепление целлюлозного материала показало, что одревесневшие элементы трахеи под изолятом SS были предварительно идентифицированы с использованием 18s рибосомальной ДНК в качестве содового мига в порядке газированных напитков для пластиковой мульчи на основе крахмала. Изолятов существенного роста не наблюдалось в минимальной среде, только в контрольной группе видны единичные белые пятна, видимые при закручивании в культуральных пробирках изолятов, VV и ZZ наблюдались с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии для изолята vv.

Спецификация представляла собой споровую массу, предположительно оставшуюся от первоначальной инокуляции. Для isolate zz. Масса состояла из рыхлой сетки гифи, примерно 0,2 миллиметра в диаметре, что позволяет предположить, что исходный споровый инокулятум пророс, но не вырос за пределы изображенной здесь массы.

Как видно здесь, в привитых ООН мерах контроля для пластиковой мульчи на основе крахмала, наблюдается неровная текстура. Идентичность белых черт лица неизвестна, но они отсутствуют в показанном здесь фильме, колонизированном изолятом VV. И белые частицы, и бугорки исчезают в пленке, колонизированной изолятом zz.

Кроме того, последний образец показал равномерное возникновение трещин на поверхности изолятов BDM. VV и ZZ были предварительно идентифицированы с использованием ats рибосомальной ДНК как Penicillium и ACE в порядке гипо соответственно. Хотя этот метод может дать представление о биоразложении пластиковой мульчи для сельскохозяйственной промышленности, он также может быть применен к любому другому пластику, биоразложение которого в окружающей среде находится под вопросом.

Например, пластик, который может оказаться в морской среде. Используются ли они в пищевой промышленности? Я.