Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения
25 июня 2014 г.
Опробование пробирке функцию β-клеток при помощи изолированных островков мыши Лангерганса является важным компонентом в изучении диабета патофизиологии и терапии. Хотя многие вниз по течению приложения доступны, этот протокол конкретно описывает измерение внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в качестве важного параметра, определяющего функцию β-клеток.
Общая цель данной процедуры заключается в выделении здоровых островков для измерения различий в продукции циклического АМФ в ответ на различные экспериментальные воздействия. Это достигается путем предварительного раздувания и последующего удаления поджелудочной железы на втором этапе. Здоровые островки выделяют с помощью серии центрифугирований и промывок.
Затем жизнеспособные глазковые диски переносят в свежую среду для культивирования островков и инкубируют в течение ночи. На заключительном этапе глазковые диски подвергают воздействию необходимых экспериментальных факторов, после чего проводят анализ на определение уровня циклического АМФ. В итоге для измерения изменений в продукции циклического АМФ в ответ на различные воздействия, примененные к глазковым дискам, используется иммуноферментный анализ.
Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями, так как для достижения полного раздувания поджелудочной железы требуется много практики. Сначала заполните шприц и канюлю пятью миллилитрами раствора коллагеназы. Установите на канюлю тупоконечную иглу 30-го калибра и поместите шприц с канюлей на лед.
После смещения тонкого кишечника мыши в правую сторону найдите сфинктер Оди, который расположен в конце общего желчного протока и расширяется на тонком кишечнике, образуя белый треугольник. После обнаружения сфинктера возьмите пинцет Dumont №5 и аккуратно просуньте его кончик под общий желчный проток как можно ближе к тонкому кишечнику, стараясь не проколоть проток.
После прокола тонкой кишки и соединительной ткани с помощью кончика пинцета Dumont захватите шовную нить и протяните ее под общий желчный проток. Перевяжите общий желчный проток как можно ближе к сфинктеру Одди, убедившись, что узел затянут плотно для предотвращения утечки. Затем захватите оба конца нити и потяните их в сторону хвоста, чтобы создать некоторое натяжение общего желчного протока.
Затем, удерживая концы нити так, чтобы общий желчный проток был натянут, свободной рукой сделайте микроножницами небольшой разрез в общем желчном протоке чуть выше последнего раздвоения, ведущего в печень. Извлеките шприц и канюлю из ведерка со льдом. Отложите шприц и введите подготовленную затупленную иглу 30-го калибра в место разреза.
Общий желчный проток. Будьте осторожны, чтобы не проколоть стенку протока. Добиться полного раздувания поджелудочной железы — самая сложная часть.
Мы используем иглу, обеспечивающую герметичное соединение. Если первая игла не обеспечивает герметичности, используйте иглу большего размера, например, 27-го калибра. Теперь медленно нажимайте на plunger шприца, сбрасывая давление пульсирующим образом, пока не раздуется первая часть поджелудочной железы.
После этого прикладывайте осторожное постоянное давление до тех пор, пока поджелудочная железа не перестанет раздуваться. При успешном раздувании экзокринная ткань будет распределена равномерно, а часть поджелудочной железы, расположенная над желудком, будет раздута. Чтобы извлечь поджелудочную железу, зажмите тонкую кишку в области сфинктера Од с помощью пинцета в одной руке.
Другой рукой введите закрытый кончик изогнутых ножниц, чтобы отделить часть поджелудочной железы от тонкого кишечника. Переместите кончик ножниц вниз по тонкому кишечнику к розовой соединительной ткани. Затем захватите тонкий кишечник рядом с местом его прикрепления к желудку и отсеките поджелудочную железу от остальной части тонкого кишечника.
Захватите максимально возможную часть поджелудочной железы и аккуратно приподнимите её. С помощью изогнутых ножниц перережьте оставшиеся связи между поджелудочной железой и грудной полостью.
Для полного извлечения поджелудочной железы поместите каждую удаленную железу примерно в 2,5 миллилитра раствора коллагеназы. Подготовьте индивидуальные конические пробирки объемом 50 миллилитров на льду для промывки поджелудочных желез. Сначала перенесите каждую поджелудочную железу в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 25 миллилитров коллагеназы.
Затем поместите конические пробирки объемом 50 мл с поджелудочной железой вертикально в встряхивающую водяную баню при 37 °C, способную работать с частотой 220–250 об/мин, при выключенном шейкере. Затем продуйте каждую коническую пробирку объемом 50 мл смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа в течение пяти минут.
С помощью пастуровской пипетки плотно закройте каждую пробирку и поместите их горизонтально в шейкер-термостат, погрузив под поверхность воды. Начиная с шестой минуты, встряхивайте пробирки с частотой 220–250 RPM по 20 секунд каждую вторую минуту в течение максимум 16 минут. После встряхивания центрифугируйте пробирки при 400–500 Gs при комнатной температуре, немедленно выключив центрифугу сразу после достижения ею полной скорости.
Затем, не тревожа осадок, с помощью вакуумного аспиратора удалите около 22.5 milliliters раствора коллагеназы из каждой пробирки. После этого ресуспендируйте осадки в 12.5 milliliter HBSS и осторожно перемешайте пробирки на вортексе для разрушения осадка. После промывки, вортексирования клеток и добавления HBSS, перелейте каждую клеточную суспензию через сетку с размером ячейки 1000 micron в новые индивидуальные конические пробирки объемом 50 milliliter.
Затем после повторного центрифугирования суспензий клеток используйте вакуумный аспиратор, чтобы осторожно удалить весь раствор HBSS, не повреждая осадок. После полного удаления HBSS добавьте в каждую пробирку 4,8 миллилитра 25%F call solution. После перемешивания на вортексе для разрушения осадка осторожно внесите 2,4 миллилитра 23%20.5%and 11%fial solution по стенке, вращая коническую пробирку объемом 50 миллилитров.
Чтобы обеспечить равномерное распределение слоев после центрифугирования раствора для вызова FI, перелейте весь раствор FI в новую коническую пробирку объемом 50 мл, стараясь не задеть осадок экзокринной ткани. Добавьте в новую пробирку ледяной раствор HBSS до отметки 50 мл. Затем закройте пробирку крышкой и переверните ее четыре-шесть раз.
Смешайте FI call и HBSS. С помощью вакуумного аспиратора осторожно удалите большую часть смеси HBSS из флакона, стараясь не потревожить рыхлый осадок. Затем перенесите осадок в новую пробирку.
С помощью пастеровской пипетки перенесите глазки в чашку Петри с культуральной средой для глазков, стараясь не переносить фрагменты тканей ASIN art. Поместите чашку Петри под диссекционный микроскоп с подсветкой.
Здоровые глазки будут иметь сферическую форму и золотисто-коричневый или темно-коричневый центр. Любые глазки, прикрепленные к ASIN или ткани, которые будут выглядеть тусклыми и серыми, использовать нельзя; их следует утилизировать. Кроме того, следует отбраковать более крупные глазки, в центре которых после инкубации в течение ночи развивается темный некротический очаг, так как они функционируют неправильно.
Если препарат глазков содержит большое количество детрита, дважды перенесите глазки вручную в свежую среду; добавьте ДНК в буфер для дигестии, чтобы ограничить слипание глазков. Начните этот этап, перемещая глазки круговыми движениями в центр чашки Петри. С помощью дозатора P 20 перенесите глазки в новую полистироловую чашку Петри размером 15 мм на 60 мм, содержащую 5 мл раствора для преинкубации, чтобы промыть глазки от культуральной среды, содержащей глюкозу.
Затем с помощью пипетки P 20 перенесите не менее 13 глазков в отдельные микроцентрифужные пробирки, содержащие 1 мл свежепродутого бикарбонатного буфера Кребса-Рингера, соблюдая единообразие размера глазков между пробирками. После инкубации образцов при 37 °C и 5% CO2 в течение 45 минут закройте пробирки крышками, быстро перемешайте их на вортексе и центрифугируйте в настольной центрифуге при комнатной температуре при 7 000–7 500 ×g. Если в качестве последующего анализа планируется определение инсулина или другого метаболита, с помощью пипетки P 1000 отберите аликвоту среды в микроцентрифужную пробирку. Если сбор стимулирующей среды не требуется, её можно утилизировать.
С помощью дозатора P 1000 удалите большую часть раствора Кребса из каждой микроцентрифужной пробирки, оставив примерно 10–15 µL раствора Кребса на осадке из глазков. Затем с помощью дозатора P 20 удалите часть раствора, находящуюся ближе всего к осадку. Наконец, когда на глазках останется менее 10–15 µL раствора Кребса, подвергните осадки из глазков мгновенной заморозке в жидком азоте.
Затем храните мгновенно замороженные осадки при температуре −80 °C до измерения уровня циклического АМФ. Как правило, влияние препарата на выработку циклического АМФ напрямую коррелирует с его влиянием на секрецию инсулина. В данном эксперименте изолированные островки от мышей дикого типа или нокаутных мышей стимулировали 11,1 мМ глюкозой и определяли внутриклеточный циклический.
Уровень продукции цАМФ измеряли и нормировали по общему количеству клеточного белка. Секретируемый инсулин определяли с помощью стандартного ИФА-анализа на инсулин и также нормировали по общему количеству клеточного белка. Как и ожидалось, изменение продукции цАМФ напрямую коррелировало с усилением глюкозозависимой секреции инсулина.
После просмотра этого видео вы сможете выделить культуру и измерить уровни циклического ампа и гмпа в здоровых глазках мышей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод выделения островков Лангерганса мыши для оценки функции β-клеток путем измерения уровня циклического аденозинмонофосфата (cAMP). В нем подробно изложены этапы выделения здоровых островков и проведения анализа cAMP для оценки их реакции на различные виды обработки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Исследование диабета
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Изолированные островки мыши имеют решающее значение для изучения диабета.
- cAMP является ключевым индикатором функции β-клеток.
- Понимание ответа β-клеток может помочь в разработке методов терапии диабета.
- Методы изоляции островков необходимы для получения точных измерений.
Цель исследования
- Для выделения здоровых островков для функциональных анализов.
- Для измерения продукции cAMP в ответ на воздействие препаратов.
- Для углубления понимания физиологии β-клеток при диабете.
Используемые методы
- Раздувание и удаление поджелудочной железы.
- Изоляция островков путем центрифугирования и промывки.
- Инкубация жизнеспособных островков в культуральной среде.
- Иммуноферментный анализ для измерения уровней cAMP.
Основные результаты
- Успешное выделение жизнеспособных островков.
- Количественное измерение продукции cAMP.
- Вариабельность ответа cAMP на различные виды обработки.
- Представления о функции β-клеток в экспериментальных условиях.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно изолировать островки для проведения функциональных анализов.
- Уровни cAMP дают ценную информацию о состоянии β-клеток.
- Полученные результаты могут внести вклад в исследование диабета и разработку методов терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Надежное выделение островков поджелудочной железы мыши и количественное измерение внутриклеточного cAMP напрямую способствуют валидации мишеней на ранних стадиях разработки препаратов для лечения диабета и снижению механистических рисков. Данный рабочий процесс позволяет точно исследовать сигнальные пути β-клеток, в частности те, которые модулируются рецепторами инкретинов, что повышает прогностическую достоверность при проверке терапевтических гипотез. Чистота подготовки островков и количественные результаты делают данный протокол универсальной платформой для комплексной оценки функции β-клеток и ответа на лекарственные препараты в рамках всего портфеля разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямую оценку сигналинга β-клеток в ответ на воздействие потенциальных модуляторов.
- Обеспечивает механизм снижения рисков путем количественного определения cAMP как функционального показателя активации рецепторов.
- Способствует проведению гипотетической оценки инкретиновых и родственных им путей в моделях диабета.
- Создает основу для функциональной валидации мишеней и уточнения сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных, очищенных от клеточного дебриса препаратов островков, подходящих для воспроизводимых последующих анализов.
- Позволяет проводить количественное измерение cAMP для разработки методов анализа и скрининга соединений.
- Поддерживает масштабируемость и повторное использование платформы для нескольких показателей, включая секрецию инсулина и экспрессию генов.
- Повышает надежность оценки соединений за счет обеспечения постоянства биологического материала.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям дисфункции β-клеток, имеющим значение для заболевания, что позволяет проводить трансляционные исследования биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации методов воздействия, направленных на β-клетки.
- Поддерживает принятие обоснованных решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков за счет предоставления механистических и функциональных данных.
- Способствует интеграции данных о секреции инсулина и уровнях cAMP для получения прогностических трансляционных выводов.
Интеграция в пайплайн и рабочий процесс
Данный метод применяется на стыке этапов раннего поиска и доклинических исследований, поддерживая рабочие процессы от валидации мишени до идентификации ведущих соединений и согласования трансляционных биомаркеров.
- Открывательная биология: обеспечивает платформу для проверки гипотез и анализа путей передачи сигналов в β-клетках.
- Скрининг: предоставляет валидированные препараты островков и количественные показатели cAMP для подготовки анализа.
- Аналитика: позволяет проводить нормализацию данных о секреции cAMP и инсулина по общему количеству белка для надежного сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает механистические выводы с моделями релевантными заболеванию и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированный протокол, адаптируемый для множества последующих применений в различных научно-исследовательских группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней в β-клетках и в механистических исследованиях.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию анализов на основе островков.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних стадиях в портфелях препаратов для лечения диабета.
- Влияние на портфель: способствует приоритезации программ по β-клеткам и инкретиновому пути с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Для достижения оптимального выхода и жизнеспособности клеток требуются технические навыки в области хирургии на мышах и изоляции островков.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для обработки тканей, культивирования клеток и проведения иммуноферментного анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация методов отбора и обращения с островками для обеспечения сопоставимости данных.
- Метод adaptable к различным видам последующего анализа, однако практическими ограничениями являются период обучения оператора и вариабельность тканей.
- Протокол поддерживает, но не автоматизирует интеграцию с другими функциональными и молекулярными методами анализа.
