Количественный Мультиспектральный Анализ После Люминесцентная трансплантации тканей для визуализации клеточных Origins, типы и взаимодействий

Целью данной процедуры является использование мультиспектрального опроса мультиплексных клеточных композиций или имитации для определения вклада различных резидентных популяций костного мозга в развитие стромы опухолей. Это достигается путем первичной трансплантации меченной трансгенной GFP мыши-реципиента с RFP, экспрессирующими стволовые клетки костного мозга. На втором этапе представляющие интерес опухолевые клетки вводятся тому же реципиенту, а затем после приживления акцизная опухоль разделяется, встраивается в парафин и мечется иммунофлуоресцентными антителами.

Затем, после того как спектральная библиотека будет завершена, создается спектральная библиотека всех длин волн, используемых для получения изображений участков опухоли. На заключительном этапе слайды визуализируются, выполняется анализ данных, позволяющий идентифицировать и ассоциировать паттерны окрашивания представляющих интерес клеточных маркеров. В конечном счете, новые клеточные сущности или фенотипы могут быть идентифицированы на основе мультиплексного мечения внеклеточных и клеточных маркеров, чтобы лучше понять состав сложных тканей, таких как микроокружение опухоли.

Основное преимущество этой методики перед стандартными иммунофлуоресцентными методиками заключается в том, что мультиспектральный анализ позволяет мультиплексировать семь и более флюорочетверов на одном предметном стекле, что позволяет гораздо точнее и детальнее исследовать клеточный состав опухолевого микроокружения или регенеративной ткани. Хотя этот метод может дать представление о происхождении и составе опухолевого микроокружения, он может быть применен к другим системам, таким как регенеративная медицина, биология развития и иммунная биология. Вместе с доктором Спа эту процедуру демонстрирует Крис Бут, научный сотрудник моей лаборатории. Из-за ограничений IU Cook в этом учреждении мы будем обсуждать, но не будем показывать какие-либо прямые манипуляции с мышами.

Эти процедуры на костном мозге и наши методы приживления опухолей можно найти в наших предыдущих работах, таких как стволовые клетки Kid и других. 2009 Чтобы начать после выделения клеток костного мозга из зеркальных задних конечностей, резационная суспензия клеток в концентрации 2 миллиона клеток на 100 микролитров PBS на мышь. Используйте тепловую лампу для расширения сосудов облученной мыши GFP и поместите мышь в удерживающее устройство для инъекции в хвостовую вену.

С помощью иглы 29 калибра скошенной стороной вверх системно вводите клеточные суспензии в хвост или ретроорбитальную вену. Используйте стерильную марлю для легкого надавливания на хвост после инъекции. Вводите одной мыши 100 микролитров PBS только в качестве средства контроля приживления в день инъекции.

Ресуспендировать интересующие опухолевые клетки в PBS в концентрации 1 миллион клеток на 100 микролитров. После стерилизуют брюшную полость 70%этанолом. Одной рукой удерживайте мышь за загривок шеи и хвост, а затем другой рукой держите иглу скошенной стороной вверх и вводите опухолевые клетки в межбрюшинную полость мыши-реципиента.

Через 15-30 дней усыпьте мышей и удалите опухоль из брюшной полости. Затем фиксируют опухоли в 10%-ном формине в течение 24 часов. Затем разрежьте неподвижную ткань на срезы от пяти до 10 микрометров для последующих процедур окрашивания.

После фиксации участков ткани в парафине запекайте образцы в течение часа при температуре 56 градусов Цельсия. Затем промойте горки в следующей последовательности После последней промывки этанолом промойте горки в воде в течение двух минут. Медленно погружая и поднимая решетку для окрашивания в воду и из воды 10 раз.

Далее поместите буфер цитрата натрия в микроволновую печь для разогрева. После кипячения предметных стекол в течение 20 минут в буфере цитрата натрия дайте образцам остыть в буфере в течение 30 минут. Затем умывайтесь ионизированной водой еще пять минут.

Затем постучите по предметному стеклу, чтобы крупные капли воды скатились, будьте осторожны, чтобы не пересушить участок ткани. С помощью гидрофобной барьерной ручки отметьте участки вокруг участков опухоли, а затем немедленно поместите блокирующий буфер на образец, чтобы предотвратить высыхание участка ткани. Через час инкубируйте предметные стекла с основным интересующим антителом в камере для влаги на медленно вращающемся шейкере при температуре четыре градуса в течение ночи.

На следующее утро промойте слайды два раза в PBST в течение 10 минут, каждый раз осторожно встряхивая во время промывки секций. Разбавляйте вторичные антитела в соотношении антител к блокирующему буферу один к 1000. Затем инкубируйте срезы в соответствующих вторичных антителах во влажной камере, накрытой алюминиевой фольгой, на медленно вращающемся шейкере при комнатной температуре через два часа.

Промойте предметные стекла два раза в PBST в течение пяти минут с легким встряхиванием и бейте их от света. Затем окрасьте только предметное стекло и анализируйте предметные стекла с DPI в течение одной минуты, сохраняя предметные стекла закрытыми во время инкубации. Надев покровное стекло на каждый образец, заклейте края каждого покровного стекла отвердителем для ногтей.

Теперь, чтобы выполнить мультиспектральное изображение, используйте масляный объектив для получения исходного изображения предметного стекла, чтобы получить правильное время экспозиции для каждого из спектральных диапазонов в спектральной библиотеке. Например, в этой таблице предложены протоколы спектральной библиотеки, основанные на количестве четверок этажей, использованных в эксперименте. Затем сфотографируйте незапачканный слайд для фонового слайда в спектральной библиотеке для этого эксперимента.

Следующее изображение, неокрашенный слайд для получения фонового изображения для спектральной библиотеки. Теперь сфотографируйте каждый контрольный слайд с четырьмя пятнами, сохранив изображения под названием вторичного антитела, используемого для каждого слайда. После того как библиотека Suspectable будет готова, соберите изображения интересующих областей на предметном стекле для анализа изображений тканей опухоли.

Во-первых, импортируйте репрезентативный ассортимент полученных изображений нюансов с помощью программного обеспечения inform. Затем откройте безопасную спектральную библиотеку в соответствии с указаниями программы. Затем определите области тканей, представляющие интерес для анализа.

Идентификация отдельных клеток на основе окрашивания DAPI. Цитоплазма будет идентифицирована автоматически на основе формы ядра. Теперь выберите предпочтительное значение интенсивности флуоресценции для каждого флуоресцентного параметра, а затем сопоставьте полученные изображения, позволив программному обеспечению обрабатывать данные с использованием предложенного алгоритма.

Когда обработка изображения будет завершена, объедините полученные файлы. Затем, используя этот метод мультиспектральной визуализации для анализа и построения графиков опухолей в этой модели трансгенной трансплантации костного мозга у мышей, компоненты стромальной опухоли, которые имеют происхождение из костного мозга, были различимы с помощью проточной цитометрии через три недели после трансплантации костного мозга. Затем, через шесть недель после первоначальной инъекции, были проанализированы срезы из немеченых инъекционных опухолей яичников, после создания спектральной библиотеки с одноцветными контрольными слайдами, проанализированы изображения участка опухоли яичника, окрашенного GFP DPI и двумя другими маркерами.

Возможно добавление большего количества маркеров. Например, здесь спектральная библиотека и сопровождающее изображение участка опухоли с шестью маркерами плюс ядерное окрашивание демонстрируются с помощью информированного программного обеспечения. Представляющие интерес участки тканей в пределах опухолевого среза можно классифицировать, как показано на репрезентативных изображениях, показанных здесь.

Например, на этом изображении показана классификация сегментов ткани с последующей сегментацией клеток. На основе ядерного пятна dpi. Количественная оценка флуоресцентных меток может быть затем измерена в ядре и цитоплазме каждой клетки и экспортирована для дальнейшего анализа.

Алгоритм сегментации тканей способен дополнительно идентифицировать подтипы тканей на основе архитектуры тканей, а не только на основе идентификации флуорохромов, обеспечивая более надежный аналитический инструмент для классификации окрашивания по отдельным тканевым областям. На этом изображении компьютер был обучен идентифицировать пять подобластей на основе архитектурных паттернов внутри ткани. Фон определяется пустым пространством.

Гемолитическая опухоль определяется обилием эритроцитов в ткани. Опухоль определяется плотно заселенными клетками. Жир определяется большими симметричными пустыми клеточными компартментами, а мышцы — поперечно-полосатым рисунком.

С помощью этого метода можно проанализировать популяцию двойных положительных клеток на основе определенного порога интенсивности флуоресценции. Например, для GFP-положительных и альфа-гладкомышечных актин-положительных клеток, как показано здесь для дополнительного спектрального детектирования за пределами четырех цветов, см. связанные документы с советами и рекомендациями по мультиплексированию пяти или более зондов. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что качество изображений в значительной степени зависит от правильного использования слайдов с одним цветом.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флуоресцентная гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как клеточные компартменты и ткань микроокружения опухоли. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать нашу технику мимики, многоспектрального опроса многоклеточных компонентов, а при этом у вас должно быть полное понимание того, как идентифицировать несколько клеточных мишеней на одном слайде. Как подсчитать эти клеточные мишени в Unix и иметь хорошее представление об эволюции опухолевой стромы или регенеративной ткани, или интересующей вас ткани.