Количественный Мультиспектральный Анализ После Люминесцентная трансплантации тканей для визуализации клеточных Origins, типы и взаимодействий

Целью данной процедуры является использование мультиспектрального анализа мультиплексных клеточных составов или их имитаций для определения вклада различных резидентных популяций костного мозга в развитие стромы опухоли. Это достигается путем первоначальной трансплантации стволовых клеток костного мозга, экспрессирующих RFP, трансгенной мыши-реципиенту, меченной GFP. На втором этапе исследуемые опухолевые клетки вводятся тому же реципиенту, после чего, по завершении приживления, иссеченная опухоль подвергается секционированию, заливке в парафин и маркировке иммунофлуоресцентными антителами.

Затем, после завершения формирования спектральной библиотеки, создается библиотека всех длин волн, используемых для получения изображений срезов опухоли. На заключительном этапе проводится съемка предметных стекол и анализ данных для идентификации и сопоставления паттернов окрашивания интересующих клеточных маркеров. В конечном итоге, на основе мультиплексного мечения внеклеточных и клеточных маркеров, можно выявить новые клеточные единицы или фенотипы, чтобы лучше понять состав сложных тканей, таких как микроокружение опухоли.

Основным преимуществом этого метода по сравнению со стандартными методами иммунофлуоресценции является мультиспектральный анализ, который позволяет использовать семь или более флуорофоров на одном предметном стекле, обеспечивая гораздо более точное и детальное изучение клеточного состава микроокружения опухоли или регенерирующей ткани. Хотя данный метод позволяет получить представление о происхождении и составе микроокружения опухоли, его можно применять и в других областях, таких как регенеративная медицина, биология развития и иммунобиология. Вместе с доктором Spa эту процедуру демонстрирует Крис Бут, лаборант-исследователь в моей лаборатории. В связи с ограничениями IACUC в данном учреждении, мы обсудим, но не будем показывать какие-либо прямые манипуляции с мышами.

Эти процедуры по работе с костным мозгом и наши методы трансплантации опухоли описаны в наших предыдущих работах, таких как kid and others stem cells. 2009. После выделения клеток костного мозга из соответствующих задних конечностей ресуспендируйте клетки из расчета 2 million cells на 100 µL PBS на одну мышь. Используйте тепловую лампу для расширения сосудов облученной мыши-реципиента GFP и поместите мышь в фиксатор для инъекций в хвостовую вену.

Используя иглу 29-го калибра срезом вверх, системно введите клеточные суспензии в хвостовую или ретроорбитальную вену. После инъекции слегка прижмите основание хвоста стерильной марлей. В день проведения процедуры одной мыши введите 100 µL только PBS в качестве контроля приживления.

Ресуспендируйте интересующие клетки опухоли в PBS в концентрации 1 миллион клеток на 100 µL. После стерилизации брюшной полости 70% ethanol зафиксируйте мышь одной рукой за загривок и хвост, затем другой рукой, держа иглу срезом вверх, введите клетки опухоли в брюшную полость мыши-реципиента.

Через 15–30 дней эвтаназируют мышей и иссекают опухоль из брюшной полости. Затем опухоли фиксируют в 10% формалине в течение 24 часов. После этого фиксированную ткань нарезают на срезы толщиной от 5 до 10 мкм для последующего окрашивания.

После фиксации срезов ткани в парафине просушите образцы в печи в течение одного часа при 56 °C. Затем промойте стекла в соответствии со следующей последовательностью. После последнего промывания этанолом промывайте стекла в воде в течение двух минут, медленно погружая и поднимая штатив для окрашивания в воду 10 раз.

Затем поместите буфер с цитратом натрия в микроволновую печь для нагрева. После кипячения предметных стекол в буфере с цитратом натрия в течение 20 минут оставьте образцы охлаждаться в буфере на 30 минут. Затем промойте их ионизированной водой еще в течение пяти минут.

Затем слегка постучите по предметному стеклу, чтобы удалить крупные капли воды, стараясь не допустить пересыхания среза ткани. С помощью гидрофобного маркера обведите области вокруг срезов опухоли, после чего немедленно нанесите на образец блокирующий буфер, чтобы предотвратить высыхание ткани. Через час инкубируйте стекла с соответствующими первичными антителами в увлажненной камере на медленно вращающемся шейкере при температуре 4 °C в течение ночи.

На следующее утро промойте предметные стекла дважды в PBST по 10 минут каждый раз, осторожно встряхивая их во время промывки срезов. Разведите вторичные антитела в блокирующем буфере в соотношении 1:1000. Затем инкубируйте срезы с соответствующими вторичными антителами в камере влажности, накрытой алюминиевой фольгой, на медленно вращающемся шейкере при комнатной температуре в течение двух часов.

Промойте предметные стекла дважды в PBST по пять минут при осторожном встряхивании, защищая их от света. Затем окрасьте только стекло с dappy и стекла для анализа с помощью DPI в течение одной минуты, сохраняя стекла закрытыми во время инкубации. Наложив покровное стекло на каждый образец, загерметизируйте края каждого покровного стекла закрепителем для ногтей.

Теперь для проведения мультиспектюрной визуализации используйте иммерсионный объектив для получения исходного изображения предметного стекла с целью определения подходящего времени экспозиции для каждого спектрального диапазона в спектральной библиотеке. Например, в данной таблице представлены рекомендуемые протоколы спектральной библиотеки в зависимости от количества использованных в эксперименте флуорофоров. Затем сделайте снимок неокрашенного стекла для получения фонового изображения в спектральной библиотеке для данного эксперимента.

Затем сделайте снимок неокрашенного препарата для получения фонового изображения спектральной библиотеки. Теперь сделайте снимки каждого контрольного препарата с одним красителем, сохраняя изображения под названием вторичного антитела, использованного для каждого препарата. После завершения формирования спектральной библиотеки сделайте снимки интересующих областей на аналитическом препарате для анализа изображений опухолевых тканей.

Сначала импортируйте репрезентативный набор полученных изображений Nuance с помощью программного обеспечения InForm. Затем откройте библиотеку спектров Safe, следуя инструкциям программы. После этого определите области интереса в ткани для последующего анализа.

Идентифицируйте отдельные клетки на основе окрашивания DAPI. Цитоплазма будет определена автоматически исходя из формы ядра. Теперь выберите желаемый вариант считывания интенсивности флуоресценции для каждого флуоресцентного параметра, после чего сопоставьте полученные изображения, позволяя программному обеспечению обработать данные с использованием предложенного алгоритма.

После завершения обработки изображений объедините полученные файлы. Затем, используя данный метод мультиспектральной визуализации для анализа и графического представления опухолей в этой трансгенной модели мышей с трансплантацией костного мозга, с помощью проточной цитометрии через три недели после трансплантации костного мозга были определены стромальные компоненты опухоли, имеющие происхождение из костного мозга. Затем, через шесть недель после первой инъекции, после создания спектральной библиотеки с использованием контрольных предметных стекол с одним цветом, были проанализированы срезы немаркированных инъецированных опухолей яичников; в частности, были проанализированы изображения среза опухоли яичника, окрашенного GFP, DPI и двумя другими маркерами.

Возможно добавление большего количества маркеров. Например, здесь с помощью специализированного программного обеспечения представлены спектральная библиотека и соответствующее изображение среза опухоли с шестью маркерами и окрашиванием ядер. Области интереса в тканях среза опухоли могут быть классифицированы, как показано на представленных здесь репрезентативных изображениях.

Например, на данном изображении показана классификация сегментов ткани с последующей сегментацией клеток на основе окрашивания ядер dpi. После этого можно количественно определить флуоресцентные метки в ядре и цитоплазме каждой клетки и экспортировать данные для дальнейшего анализа.

Алгоритм сегментации тканей способен дополнительно идентифицировать подтипы тканей на основе их архитектуры, а не только по определению флуорохромов, что обеспечивает более надежный аналитический инструмент для классификации окрашивания по отдельным областям ткани. На данном изображении компьютер был обучен определять пять подобластей на основе архитектурных паттернов внутри ткани. Фон определяется как пустое пространство.

Гемолитическая опухоль характеризуется обилием эритроцитов в ткани. Опухоль определяется плотным расположением клеток. Жировая ткань характеризуется крупными симметричными пустыми клеточными компартментами, а мышечная ткань — полосатым рисунком.

С помощью данного метода можно проанализировать популяцию дважды положительных клеток на основе определенного порога интенсивности флуоресценции. Например, для GFP-положительных и положительных по альфа-гладкомышечному актину клеток; для дополнительного спектрального детектирования более четырех цветов, как показано здесь, пожалуйста, ознакомьтесь со связанными документами с советами и рекомендациями по мультиплексированию пяти и более зондов. При выполнении этой процедуры важно помнить, что качество изображений в значительной степени зависит от правильного подбора контрольных стекол с одним красителем.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как флуоресцентная гибридизация in situ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся клеточных компартментов и тканей микроокружения опухоли. После просмотра этого видео вы должны хорошо освоить нашу технику мимикрии, мультиспектральный анализ многоклеточных компонентов, а также детально понять, как идентифицировать несколько клеточных мишеней на одном предметном стекле. Вы узнаете, как подсчитывать эти клеточные мишени, и получите четкое представление об эволюции опухолевой стромы, регенерирующей ткани или другого интересующего вас типа ткани.