Дизайн двухосных механических биореактор загрузка для тканевой инженерии

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании функциональных биокомпозитов из инженерных тканей для трансплантации. Это достигается путем применения точного одноосного или двуосного механического растяжения для обеспечения биофизической стимуляции клеток в трехмерных биоматериальных композитах. На втором этапе биореактор оснащается датчиком нагрузки, который обеспечивает обратную связь по силе и позволяет проводить механические испытания биокомпозитов в процессе нагружения.

Затем биокомпозиты культивируют в течение нескольких недель для индукции макромасштабных изменений биохимического состава и прочности конструкции; полученные результаты демонстрируют влияние различных типов нагрузки, основываясь на значимых различиях в содержании гликозаминогликанов и коллагена, толщине скаффолда и модуле равновесия. Хотя данный метод позволяет понять влияние биаксиальной нагрузки на инженерную хрящевую ткань, его также можно применять к другим тканям с низкой несущей способностью, таким как кость и сухожилие. Процедуру продемонстрируют Эми Мэй и Роб Стефани из нашей лаборатории. Для начала данной процедуры установите биаксиальный биореактор, как показано здесь.

Основание биореактора представляет собой алюминиевую пластину размером 25 сантиметров на 30 сантиметров и толщиной 12,5 миллиметров. Доступные варианты регулировки позиционирования обеспечивают гибкость крепления планшетов для культивирования тканей различных форм и размеров. Затем убедитесь, что столики установлены на основании таким образом, чтобы горизонтальный столик создавал динамический сдвиг, осциллируя только вдоль оси x.

Вертикальный стол обеспечивает динамическое сжатие, совершая колебания только вдоль оси Z. Следующим шагом является изготовление специальной загрузочной пластины из полисульфона. Полисульфон идеально подходит для этой цели благодаря своей биосовместимости, простоте механической обработки и легкости стерилизации.

Соедините планшет и двухосевую подвижную платформу с помощью прецизионного обработанного Г-образного кронштейна. Кинематические ограничители, закрепленные на базовой пластине, оснащены винтами точной регулировки, что позволяет добиться точного выравнивания культуральных планшетов, которое невозможно выполнить вручную. Затем подсоедините к каждой платформе привод с шаговым двигателем, который будет передавать данные о положении в программное обеспечение.

Используемые здесь шаговые приводы обладают двунаправленной повторяемостью 0,1 micrometer и разрешением 20 nanometers, что обеспечивает точность менее трех micrometers при перемещении на расстояние 50 millimeters; управление движением платформы осуществляется с помощью программного обеспечения для прецизионного позиционирования Thor Labs. Программное обеспечение управляет шаговым двигателем для независимой и одновременной регулировки параметров нагрузки по частоте и амплитуде как для сдвига, так и для сжатия. Затем установите миниатюрный датчик силы номиналом пять фунтов между нагрузочной платиной и подвижной платформой для обеспечения обратной связи по усилию, необходимой для обнаружения контакта между платиной и конструктами, а также для оценки реакций на нагрузку.

Убедитесь, что тензодатчик обладает высокой точностью от 0.15% до 0.25% от полной шкалы, а блок дисплея тензодатчика оснащен портом RS 2 32 для обеспечения сбора данных на компьютере. Чтобы иммобилизовать образцы в лунках 24-луночного планшета, подготовьте форму для слоя агарозы толщиной 1.5 millimeter, используя систему для отливки геля с проставками 1.5 millimeter. После сборки залейте раствор 4% агарозы между двумя стеклянными пластинами и дайте смеси остыть.

Затем снимите верхнюю пластину и вырежьте из агропласта диск диаметром 16 мм. В каждом диске, соответствующем каждой лунке образца, проколите отверстие для помещения образца. Поместите готовые диски в лунки 24-луночного планшета.

Затем поместите тканевые конструкции толщиной 2,25 мм и диаметром 5 мм в каждый из держателей для геля. Образец должен выступать над верхней частью каждого держателя. Далее добавьте по 1,5 мл культуральной среды в каждую лунку и закройте крышку.

Затем поместите планшет обратно в инкубатор до начала загрузки образцов. Чтобы начать механическое нагружение тканевых конструктов, закрепите алюминиевую пластину на датчике силы и постоянно держите стерильный платиновый узел прикрепленным к вертикальной платформе. Инкубатор следует эксплуатировать в условиях низкой влажности для предотвращения выхода прибора из строя.

Затем включите контроллер шагового двигателя и ПК. Откройте пользовательскую программу технологии прецизионного позиционирования и перейдите на вкладку графического управления на обоих экранах. Нажмите кнопку «Home Zero», чтобы переместить оба шаговых двигателя в нулевое положение, которое определено как верхнее и крайнее правое положение.

Подготовьте образцы к загрузке, удалив часть среды из каждой лунки, чтобы предотвратить перелив при механической загрузке. Затем поместите 24-луночный планшет в биореактор и аккуратно совместите планшет с платформой с помощью четырех регулируемых кинематических локаторов, убедившись в точности совмещения. Выполните выравнивание с передней частью основания биореактора во вкладке графического управления.

Отрегулируйте выравнивание вручную. Точно настройте положение, нажимая на поле позиционирования для перемещения по горизонтали. Когда планшет будет выровнен по лункам, начните опускать его до первого контакта с образцами.

После достижения исходного положения перейдите на вкладку секвенсора перемещений (move sequencer) и загрузите необходимую последовательность перемещений, нажав кнопку load, или создайте собственную программу, как описано в текстовом протоколе к данному видео. Затем нажмите run, чтобы запустить программу. Программное обеспечение подаст команды на двигатели для применения выбранного режима кондиционирования к образцам.

После завершения программы вручную поднимите платформу, чтобы она находилась выше края планшета для культивирования тканей. Затем извлеките 24-луночный круглый планшет из биореактора и замените среду. В завершение осторожно снимите платину с тензодатчика и выключите приборы.

Использование двуосного биореактора, описанного в данном видео, оказало значительное влияние на количество гликозаминогликанов и коллагена, секретируемых клетками в тканеинженерных конструктах. Кондиционирование проводилось пять дней в неделю по три часа в день при осевой деформации сжатия 10% и деформации сдвига 5% с частотой 1 Гц. Через 30 дней культивирования количество гликозаминогликанов и коллагена, секретируемых хондроцитами, подвергавшимися двуосному нагружению, было значительно выше, чем в контрольных образцах. Одноосное нагружение приводило к значимому увеличению только количества гликозаминогликанов.

Кроме того, двуосное нагружение привело к созданию более толстых конструктов, но не повлияло на их эластичность. Согласно данному протоколу дозирования, после 30 дней кондиционирования и культивирования поперечные срезы тканевых конструктов окрашивали типичными маркерами хряща, включая синий шафран О и коллаген II типа. Три разные группы включали отсутствие кондиционирования, одноосное нагружение и двуосное нагружение.

Хотя во всех группах наблюдается положительное окрашивание ализановым синим, шафраном и О, в образцах с биаксиальной нагрузкой выявляется большее количество коллагена II типа по сравнению с образцами без нагрузки и с униаксиальной нагрузкой. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как прикладывать униаксиальную или биаксиальную нагрузку к развивающимся тканеинженерным конструктам.