Изоляция, обработки и анализа мышиного десен Клетки

Общая цель данной процедуры заключается в точном выделении и подготовке десны мыши для последующего анализа методом проточной цитометрии. Сначала десна аккуратно изолируется хирургическим путем. Затем иссеченная ткань подвергается обработке для получения суспензии единичных клеток.

Затем проводится внеклеточное и внутриклеточное окрашивание антителами. В завершение образец анализируют методом проточной цитометрии. В конечном итоге с помощью проточного цитометрического анализа можно получить результаты, демонстрирующие различные популяции клеток в десне и клеточные изменения, происходящие в ткани после воздействия иммунологического раздражителя.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими, такими как методы органической химии или монофлуоресценция, является то, что он представляет собой быстрый и простой способ анализа большого количества клеток, позволяющий одновременно анализировать несколько переменных, а также проводить сортировку различных типов клеток для дальнейших экспериментов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, о том, как микроорганизмы влияют на гомеостаз десен и как это связано с воспалительной потерей костной ткани в экспериментальной модели периодонтита. Идея применения этого метода возникла у нас, когда мы начали изучать роль клеток RI при периодонтите. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как технику ускорения гена GVA трудно освоить из-за малого размера и относительно затрудненного доступа к MU one J gva.

Для начала подготовьте растворы питательных сред и стерилизованные хирургические инструменты в соответствии с текстовым протоколом. После эвтаназии мыши, проведенной методами, утвержденными комитетом вашего учреждения по уходу и использованию животных, используйте острые тупоконечные прямые ножницы, чтобы сделать разрезы по обеим сторонам ротовой полости, включая щеки и ветвь нижней челюсти, и отведите нижнюю челюсть вниз, направляя стандартные ножницы перпендикулярно плоскости небной кости. Разрежьте мягкие и твердые ткани по воображаемой линии в 1 mm позади третьих моляров.

Затем сделайте разрез мягких и твердых тканей в двух миллиметрах позади резцов. После этого оттяните переднюю часть ротовой полости вниз, чтобы обнажить носовую полость, удерживая ножницы параллельно небу. Поместите один кровоостанавливающий зажим в носовую полость и с помощью другого сделайте разрез в преддверии, доходя до заднего разреза.

Повторите разрез с другой стороны верхней челюсти, чтобы отделить ее от черепа. Затем разрежьте ее посередине и с помощью абсорбентов и пинцета удалите ткани неба с каждой половины верхней челюсти, чтобы обнажить альвеолярную кость. Отделите ткани десны от переднего края и поместите их в планшет с PBS и 2% сыворотки теленка или FCS; для дальнейшей обработки десны перенесите ее в культуральную чашку с 1 mL PBS, 2 mg/mL коллагеназы типа II и 1 mg/mL ДНКазы.

Измельчите ткань стерильным хирургическим лезвием № 15. Тщательно порубите ткань перед переносом в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Смойте оставшиеся клетки ткани с планшета одним миллилитром PBS- FCS и перенесите раствор в пробирку.

Инкубируйте ткань в предварительно нагретом встряхивающем инкубаторе при 37 °C и 200 RPM в течение 20 минут. Затем добавьте 20 µL 0,5 M EDTA и инкубируйте еще 10 минут. Далее доведите объем P-B-S-F-C-S до 12 mL и центрифугируйте образец при 4 °C, 400 ×g в течение восьми минут.

После удаления супернатанта ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах PBS-FCS. Профильтруйте образец через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм, затем центрифугируйте фильтрат при температуре 4 °C и 320 ×g в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в 300 µL PBS-FCS.

Наконец, подсчитайте количество клеток, работая в ламинарном шкафу при низкой температуре и выключенном свете, в общем объеме 100 µL, добавьте от 0,2 до 0,5 µg каждого выбранного антитела на 1 × 10⁶ клеток и кратковременно перемешайте на вортексе. После инкубации образцов при 4 °C в течение 15 минут в темноте добавьте 2 mL PBS-FCS и центрифугируйте при 320 ×g и 4 °C в течение 5 минут. Для фиксации клеток аспирируйте супернатант, а затем, перемешивая на вортексе, ресуспендируйте их, покапельно добавляя 500 µL холодного BD cyto perms.

Для анализа цитотоксических эффектов инкубируйте пробирки при 4 °C в темноте в течение 40 минут, после чего подвергните образцы воздействию вортекса. Затем добавьте 1 мл буфера для промывки BD perm wash и центрифугируйте при 800 ×g при 4 °C в течение 7 минут. После повторной промывки аспирируйте весь объем промывочного буфера, оставив 300 µL.

Затем для внутриклеточного окрашивания клеток в общем объеме 100 µL добавьте по 1 µg выбранных антител на 1 × 10⁶ клеток. Кратковременно перемешайте на вортексе и инкубируйте в темноте в течение 30 минут. После двукратного промывания клеток, как описано выше, и удаления всего супернатанта ресуспендируйте клетки в 300 µL свежего холодного буфера BD perm wash buffer.

После кратковременного перемешивания на вортексе отфильтруйте суспензию в пробирки для FACS. Храните пробирки на льду или в холодильнике в темноте до начала FACS-анализа. Десневые клетки, объединенные из двух наивных мышей.

Анализ проводили на проточном цитометре LSR two с использованием программного обеспечения FlowJo. Представленные здесь графики бокового и прямого светорассеяния демонстрируют распределение клеток. Для сравнения указана стратегия гейтирования для идентификации лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток и гранулоцитов.

На этом рисунке представлен график FACS, иллюстрирующий популяцию клеток десны, очищенных из организма мышей, инфицированных P gingivalis, через 21 день после перорального введения в условиях экспериментального периодонтита. У инфицированных мышей по сравнению с представленными здесь наивными мышами легко обнаруживается увеличение различных популяций иммунных клеток. Иммунные клетки в обработанной ткани десны идентифицируются путем выделения (гейтирования) клеток, экспрессирующих гемопоэтический маркер CD 45.

Эти клетки были далее разделены на CD3-положительные T-клетки, представленные на данном рисунке. Нейтрофилы также были идентифицированы по экспрессии молекул Ly6G и CD11b. Наконец, клетки Лангерганса и эпителиальный подмножество дендритных клеток были определены путем выделения MHC-класса II-положительных CD11c-положительных клеток и анализа экспрессии EPCAM и CD207. При должном навыке и правильном соблюдении данной процедуры выполнение этой техники может занять от трех с половиной до пяти часов.

Для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как экспрессия генов в единичных клетках, после разработки метода можно использовать другие подходы, например ПЦР в реальном времени. Этот метод открыл исследователям в области иммунологии путь к изучению локального ответа в ГВА десны на любые повреждающие воздействия в рамках исследований заболеваний периодонта. Данная методика позволила нам выяснить роль иммунных и неиммунных клеток ГВА десны в патогенезе экспериментального периодонтита.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать и обрабатывать GVA из мочи для получения суспензии единичных клеток, которая в дальнейшем будет подвергнута внеклеточному и внутриклеточному окрашиванию на вирусы для анализа методом проточной цитометрии.