Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток

Общая цель данной процедуры заключается в быстром индуцировании сахарного диабета 1-го типа у мышей путем переноса диабетогенных T-клеток от трансгенных мышей мышам с отсутствием эндогенных t- и b-клеток. Начните с забора селезёнок и лимфатических узлов у мышей-доноров и очистки CD4-положительных T-клеток. Затем проведите адаптивный перенос очищенных T-клеток донора мышам-реципиентам линии nude.

Затем наблюдайте за мышами-реципиентами на предмет развития сахарного диабета 1-го типа. В конечном итоге данный протокол может быть использован для изучения патогенеза диабета и исследования терапевтических вмешательств в сравнении с другими методами. Основным преимуществом данного метода переноса BDC 2.5 CD4-положительных Т-клеток не-nsg реципиентам является быстрое и воспроизводимое развитие сахарного диабета 1-го типа.

Для получения CD4-положительных T-клеток доноров с диабетогенным фенотипом используйте шестинедельных самок мышей линии BDC 2.5 с преддиабетом, отсутствие диабета у которых подтверждено измерением уровня глюкозы в моче. Для извлечения селезенки и лимфатических узлов смочите шерсть 70% ethanol, затем сделайте разрез кожи и отодвиньте ее до обнажения мышц передних конечностей. У основания передних конечностей с каждой стороны должны быть видны два лимфатических узла. Осторожно захватите каждый лимфатический узел маленьким пинцетом и извлеките его, подрезая соединительную ткань.

Затем с помощью маленьких ножниц сделайте разрез брюшины длиной в один дюйм. Теперь аккуратно захватите селезенку в центре. Осторожно удалите соединительную ткань и прилегающий жир.

Затем извлеките селезенку, перенесите селезенки и лимфатические узлы в 10 мл DMEM на льду. С помощью поршня стерильного шприца объемом 10 мл аккуратно пропустите лимфоидные органы через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм для получения суспензии единичных клеток.

Несколько раз промойте каждое сито 1 мл DMEM, чтобы максимально увеличить выход клеток. Затем перенесите собранные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 400 Gs в течение семи минут. При комнатной температуре ресуспендируйте клеточный осадок в 3 мл буфера CK.

Теперь инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Для лизиса эритроцитов добавьте 12 мл DMEM и осадите клетки путем центрифугирования. Промойте осадок клеток один раз в 10 мл DMEM.

Затем мы суспендируем клетки в пяти миллилитрах буфера для окрашивания Fact, после чего с помощью фазово-контрастного микроскопа и гемоцитометра подсчитываем количество жизнеспособных клеток. Теперь отберите примерно 1 × 10⁶ клеток на один контрольный образец окрашивания. Также окрасьте клетки мышиными моноклональными антителами для последующей сортировки неактивированных трансгенных CD4-положительных T-клеток.

Инкубируйте все эти образцы при температуре 4 °C в темноте в течение 30 минут. Затем промойте клетки FACS-буфером в объеме, в три раза превышающем объем красителя, и ресуспендируйте клетки в FACS-буфере до концентрации 1–2 × 10⁷ клеток/мл для образца к сортировке и в 300 µL для контролей однократного окрашивания. После этого пропустите образец клеток через колпачок с клеточным фильтром 35 µm.

Для удаления клеточных агрегатов подготовьте образцы для клеточного сортера с помощью квалифицированного оператора. Заложите около трех часов, включая время настройки, для сортировки примерно 1,5 × 10⁸ трансгенных наивных CD4-положительных Т-клеток. Ожидаемый выход составляет около 2,5 × 10⁶ клеток на мышь, а скорость сортировки на таком приборе, как BD FACSAria, составит примерно 2 × 10⁴ событий в секунду. Соберите отсортированные клетки в 3 мл DMEM.

Зафиксируйте абсолютное количество отсортированных клеток и центрифугируйте их в течение семи минут. При 400 Gs суспендируйте клеточные осадки в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе для адаптивного переноса Т-клеток. Используя шприц объемом 1 мл с иглой 18 калибра, аккуратно ресуспендируйте очищенные с помощью FACS CD4-положительные Т-клетки.

Наберите раствор в шприц объемом 1 мл, затем, в preparation к инъекции, прикрепите к шприцу иглу калибра 27,5 G. Зафиксируйте мышей-реципиентов нокдаун-линии и протрите хвост 70% ethanol для дезинфекции места инъекции. Затем введите по 1×10⁶ очищенных CD4-положительных T-клеток каждой мыши в одну из латеральных хвостовых вен.

При выполнении инъекций в хвостовую вену следите за тем, чтобы не прилагать избыточного усилия при нажатии на plunger. Если игла действительно находится в вене, введение препарата должно проходить практически без сопротивления. Начиная с пятого дня после переноса T-клеток, ежедневно наблюдайте за мышами-реципиентами линии nod skid на предмет развития сахарного диабета 1-го типа.

Измерьте уровень глюкозы в моче с помощью тест-полосок в соответствии с инструкциями производителя. Обратите внимание, что мыши с двумя последовательными показателями глюкозы в моче выше 250 mg/dL считаются диабетическими. В типичном эксперименте от каждой мыши-донора BDC 2.5 после сортинга клеток получают примерно 2,5 × 10⁶ наивных трансгенных CD4-положительных Т-клеток. После адаптивного переноса диабетогенных CD4-положительных Т-клеток проводился мониторинг концентрации глюкозы в моче у мышей.

Адоптивный перенос небольшого количества клеток от мышей-доноров линии BDC 2.5 вызывал развитие сахарного диабета 1-го типа у всех реципиентов, кроме мышей линии skid, к 11-му дню. При правильном выполнении эта процедура занимает примерно восемь часов — от забора органов до переноса Т-клеток.