Определение микробной внеклеточной ферментативной активности в вод, почв и донных отложений с использованием высокой пропускной MICROPLATE Анализы

Общая цель следующей процедуры заключается в экспресс-анализе активности внеклеточных ферментов микроорганизмов в различных природных средах. Это достигается путем внесения образцов воды или почвенных суспензий в микропланшет для обеспечения достаточного количества повторностей. На втором этапе в лунки микропланшета добавляется искусственный колориметрический или флуориметрический субстрат, что позволяет протекать ферментативным реакциям. Затем измеряется абсорбция или флуоресценция для определения количества конечного продукта, высвободившегося в ходе реакции.

Результаты демонстрируют различия в активности внеклеточных ферментов между образцами на основании абсорбции или флуоресценции конечной реакции. Сегодня мы продемонстрируем, как измерять активность внеклеточных ферментов в природных средах. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы микробной экологии, такие как скорость переработки органического вещества в воде и минерализации питательных веществ в почвах, отложениях и водах. Как правило, начинающие пользователи этого метода сталкиваются с трудностями из-за сложности отделения частиц от реакционного раствора, особенно при анализе большого количества образцов.

Визуальная демонстрация этой процедуры имеет решающее значение, так как схему расположения лунок на планшете может быть трудно запомнить, а проведение измерений в несколько временных точек может усложнить выполнение процедуры. Колориметрический анализ активности внеклеточных ферментов в почвах и донных отложениях начинается с приготовления буферного раствора субстрата и стандартных растворов; согласно текстовому протоколу для почвы, приготовьте суспензию каждого исследуемого образца в стерильной центрифужной пробирке объемом 15 мл. Для донных отложений используйте 50 мM ацетатный буфер, чтобы получить концентрацию примерно 1 г/мл.

Добавьте достаточное количество ацетатного буфера, чтобы суспензия стала легко переносимой с помощью пипетки. Точный объем необходимой суспензии будет зависеть от количества анализируемых ферментов, однако рекомендуется использовать минимум five milliliters. Перемешивайте каждую суспензию на вортексе до полного распада всех комков почвы или осадка.

Также обратите внимание на конечный объем. Перед дозированием обрежьте кончики наконечников дозатора ножницами. Поскольку почвенные суспензии склонны забивать наконечники, повторно перемешайте каждую суспензию на вортексе и немедленно перенесите по 150 microliters в каждую из шести лунок.

В блоке с 96 глубокими лунками. Важно тщательно и часто перемешивать образцы на вортексе. Чтобы поддерживать частицы почвы во взвешенном состоянии, оставьте в каждом блоке не менее двух пустых лунок в качестве контроля субстрата.

Подготовьте один 96-луночный планшет для каждого фермента, подлежащего анализу. Налейте приблизительно 5 мл ацетатного буфера в резервуар для дозатора и с помощью 8-канального дозатора добавьте по 150 µL буфера в две последние лунки каждого образца.

Для контролей буфера образца и двух лунок контроля субстрата. Налейте примерно 10 milliliters соответствующего раствора p-нитрофенилфосфата или раствора субстрата PNP в резервуар для пипетки и с помощью восьмиканального дозатора добавьте 150 microliters раствора субстрата в первые четыре лунки каждого образца и в две лунки контроля субстрата. Зафиксируйте время начала реакции сразу после добавления раствора субстрата.

Инкубируйте планшеты при комнатной температуре от 0,5 до четырех часов. Точное время инкубации будет зависеть от уровня активности в образцах и определяемого фермента. Во время инкубации подготовьте один прозрачный 96-луночный микропланшет.

Для измерения абсорбции в каждом блоке с глубокими лунками с помощью пипетки внесите 190 µL дистиллированной воды и 10 µL 1 М гидроксида натрия в каждую лунку микропланшета. Гидроксид натрия замедляет ферментативную реакцию и повышает pH, что усиливает окраску PNP, высвобождаемого в ходе реакции после инкубации. Центрифугируйте 96-луночные блоки при 2000–5000 ×g в течение пяти минут для осаждения частиц почвы.

Удаление жидкости без повреждения осадка может быть затруднительным. С самого начала следует избегать использования слишком большого объема пробы почвы. Убедитесь, что центрифугирование проводилось в течение достаточного времени, и извлекайте жидкость осторожным, но уверенным движением.

С помощью многоканального дозатора отберите по 100 µL из каждой лунки, стараясь не задеть осадок. Перенесите жидкость в соответствующую лунку подготовленного прозрачного 96-луночного микропланшета. Включите планшетный ридер и запустите необходимое программное обеспечение. Измерьте оптическую плотность при 410 nm. После определения сухой массы образцов, как описано в текстовом протоколе, рассчитайте окончательную оптическую плотность каждого образца, вычтя значение оптической плотности контрольного образца из значения оптической плотности исследуемого образца.

Если значения оптической плотности контрольных проб субстрата превышают 0,060, их следует вычесть. Далее рассчитайте активность фермента в микромолях в час на грамм сухой массы, используя данное уравнение. Подготовив черный микропланшет для каждого фермента в соответствии с примером, приведенным в текстовом протоколе, налейте примерно пять миллилитров первой пробы воды в резервуар для дозатора и с помощью восьмиканального дозатора внесите по 200 µL во все лунки.

В первом столбце микропластины для сброса используйте наконечники дозатора и повторяйте процедуру по мере необходимости для каждого образца воды, чтобы заполнить столбцы с первого по девятый. Подготовьте контроли для учета образцов, стандартов, субстрата и гашения на той же черной микропластине, что и образцы. Контроли образцов содержат пробу воды и бикарбонатный буфер; они не используются в расчетах активности, но служат для подтверждения стабильности показаний на протяжении всего эксперимента.

Контроли гашения состоят из пробной воды и стандартного количества флуоресцентной метки и используются для измерения дифракции флуоресценции. Контроли субстрата в пробной воде и стандартные контроли готовят из либо связанного субстрата, либо стандартной флуоресцентной метки соответственно, и бикарбонатного буфера. Налейте примерно 5 mL 5 mM бикарбонатного буфера в чистый резервуар для пипетки.

Внесите по 50 мкл буфера в лунки с 1 по 9 в рядах D и E микропланшета, чтобы создать две повторности контрольных лунок для каждого образца; замените наконечники пипеток, затем перенесите по 200 мкл бикарбонатного буфера в лунки с 10 по 12 в рядах A и H. Хотя в данной демонстрации для целей съемки поддерживается яркое освещение, интенсивность окружающего света следует снизить, приглушив или выключив свет, так как флуоресцентный стандарт чувствителен к свету. Налейте примерно 5 мл 10 мкМ раствора 4-метил-умбеллиферона (MUB) в чистый резервуар для пипетки и внесите по 50 мкл в лунки с 1 по 12 в ряду H. Затем внесите по 50 мкл в лунки с 1 по 9 в рядах G и F, чтобы создать три повторности контролей гашения для каждого образца и общие контрольные стандарты. Поместите микропланшет в темное место или накройте непрозрачной крышкой, чтобы уменьшить фотодеградацию MUB; включите флуориметр и настройте необходимое программное обеспечение, чтобы прибор был готов к считыванию перед добавлением субстрата.

Налейте примерно 5 мл соответствующего субстрата с MUB в чистый резервуар для пипетки; с помощью 12-канального дозатора внесите по 50 µL в лунки с 1 по 12 в ряду A и в лунки с 1 по 9 в рядах B и C, чтобы сформировать три повторности для каждого образца и три контроля субстрата. Немедленно приступайте к измерению флуоресценции. Измерьте исходную флуоресценцию сразу после добавления субстрата в микропланшет. После измерения флуоресценции инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в темноте или под непрозрачной крышкой.

Для уменьшения световой деградации MUB. Время инкубации, необходимое для измерения максимальной потенциальной активности фермента, будет зависеть от концентрации фермента в образце. Поскольку эта величина неизвестна, перед анализом образца необходимо будет проводить считывание микропланшета через определенные интервалы времени.

Для большинства ферментов подходящим будет интервал в 10–15 минут в течение часа, хотя в некоторых образцах с высокими концентрациями пик будет достигнут быстрее чем за 10 минут. Продолжайте измерять флуоресценцию в микропланшете с заданными интервалами в течение как минимум одного часа. Обязательно держите микропланшет закрытым или в темноте между измерениями.

Для каждого образца в каждом временном интервале рассчитайте среднюю начальную флуоресценцию образца, среднюю конечную флуоресценцию образца, среднюю стандартную флуоресценцию и среднюю флуоресценцию контрольного гашения для каждого временного интервала. Рассчитайте активность фермента в м за час на миллилитр, используя уравнение, приведенное в текстовом протоколе.

Изучите значения активности, рассчитанные для каждого временного шага, и определите окончательную потенциальную активность по временному шагу с наивысшим показателем активности. Если значения активности продолжают расти, может потребоваться расчет для более поздних временных шагов. Если значения активности снижаются на протяжении всего запуска, повторите запуск с более короткими временными шагами.

Почвы и водные осадки обычно обладают значительным уровнем активности внеклеточных ферментов, что является результатом функционирования прикрепленных микробных сообществ, растущих на поверхности частиц. На данном рисунке показано, как эта активность изменяется в зависимости от размера частиц, полученных из поверхностного слоя отложений ручья третьего порядка в северной части штата Миссисипи, США. Предыдущее исследование показало, что бактериальные сообщества на частицах осадков из этого ручья могут быть разделены на три отчетливые группы на основе молекулярного анализа структуры их сообщества.

Образцы на частицах размером 0,063 мм, на частицах 0,125, 0,25 и 0,5 мм, а также на частицах размером 1 мм. Анализ закономерностей активности внеклеточных ферментов подтверждает этот вывод: активность фосфатазы была схожей на частицах 0,125, 0,25 и 0,5 мм, но значительно выше в фракциях 1 и 0,063 мм при измерении методом с использованием связанного субстрата PNP. Другие ферменты, такие как бета-глюкозидаза и N-ацетилглюкозаминидаза (NAG), демонстрируют аналогичные пики на самых мелких частицах, но их активность не повышена на частицах размером 1 мм.

Данный результат подчеркивает тот факт, что различные ферменты могут иметь разное распределение в окружающей среде, которое можно выявить с помощью этого анализа. Относительно низкие значения планок погрешностей свидетельствуют о том, что колориметрические анализы активности ферментов в донных отложениях воспроизводимы и, следовательно, пригодны для статистического анализа. При сравнении различных проб из окружающей среды обнаруживается, что в природных водах активность внеклеточных ферментов на миллилитр, как правило, ниже, чем в почвах или донных отложениях на грамм.

Таким образом, их следует анализировать флориметрически с использованием субстратов, связанных с MUB. На этом рисунке показано, как активность ферментов — фосфатазы, бета-глюкозидазы и NGA — изменяется в зависимости от глубины. Известно, что мелководное озеро на севере Миссисипи, США, бедно питательными веществами, о чем также свидетельствует относительно высокая активность фосфатазы и фермента, которые микроорганизмы вырабатывают для получения фосфата из органических соединений.

Для всех трех ферментов образцы для анализа, отобранные с поверхности воды и с глубины 50 сантиметров, продемонстрировали схожую активность. Несмотря на повышенную активность в образце с глубины 100 сантиметров, этот образец был фактически взят из зоны раздела вода-осадок, и присутствие частиц осадка в пробе, вероятно, объясняет более высокую активность, особенно для бета-глюкозидаз и N-ацетилглюкозаминидаз. Как и в случае с субстратами PNP, малые планки погрешностей показывают, что даже при всего трех повторных измерениях воспроизводимость флуориметрического анализа с использованием MUB-субстратов остается высокой.

Обратите внимание, что единицы активности ферментов в пробах воды выражены в нмоль потребленного субстрата, тогда как для активности ферментов в частицах осадка они выражены в микромолях потребленного субстрата, несмотря на сопоставимость величин в пересчете на единицу размера. Это подчеркивает тот факт, что почвы и осадки, как правило, обладают гораздо более высокой внеклеточной активностью, чем природные воды. Это также демонстрирует повышенную чувствительность метода с использованием субстратов, связанных с MUB, и необходимость применения данного метода для анализа внеклеточной ферментативной активности в пробах воды после освоения данной методики.

Данный метод позволяет проанализировать до девяти проб воды на наличие ферментов всего за час с небольшим. При применении этой процедуры для почв и донных отложений важно использовать материал с известной массой, чтобы активность можно было выразить в пересчете на сухую массу. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как измерять активность внеклеточных ферментов в различных природных средах, используя колориметрические или флуориметрические методы.