Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Общая цель данного эксперимента заключается в проведении эктомических исследований для сравнения профилей взаимодействия белков различных вариантов патогена с общим набором клеточных факторов. Это достигается путем скрещивания дрожжей на основе спаривания, двух гибридных скринингов CDNA для выявления потенциальных взаимодействующих партнеров белков из разных вариантов патогенов. На втором этапе взаимодействующие партнеры открывают кадры считывания и переводятся в векторы, совместимые с ними, для дальнейшей валидации.

Затем отбирается набор индивидуальных партнеров, полученных в результате всех двух гибридных скринингов, и повторно проверяется на их взаимодействие со всем спектром изучаемых штаммов. Это делается с помощью ортогонального анализа комплементации белковых фрагментов на основе люциферазы, проводимого в клетках млекопитающих, с целью получения надежных наборов данных о сравнительном взаимодействии. Результаты показывают различную интенсивность взаимодействия между белками патогена и клеточными белками на основе полученных показателей люциферазы и, таким образом, обеспечивают сравнительный обзор взаимодействий белков патогена и хозяина.

Обработка профилей взаимодействий с помощью иерархической кластеризации коррелирует специфические взаимодействия патогенов хозяина с патологическими признаками и дает представление об участии белков патогенов в патогенезе. Основное преимущество этого подхода по сравнению с другими методами картирования белковых взаимодействий патогена с белком хозяина заключается в том, что он обеспечивает строгий сравнительный набор данных о взаимодействии между несколькими вариантами штаммов. Эти методы дают представление о сети взаимодействия белка патогена, но они также могут быть применены к другим системам в качестве инфекционной молекулы с использованием полных вирусов и генетики рек, например, начните этот протокол с спаривания и распространения дрожжевых клеток, как описано в письменном протоколе.

30 миллилитров селективной отсечной среды с отсутствующим триптофаном с несколькими колониями штамма дрожжей AH 1 0 9 трансформировались с помощью семерной плазмиды P-G-B-K-T семерки, экспрессирующей белок патогена. Инкубировать 30 часов при температуре 30 градусов Цельсия с вращением. Далее затравка, 200 миллилитров селективной выпадающей среды минус триптофан с 30 миллилитрами АГ 1 0 9.

Культуры инкубируют при ротации в течение 20 часов при 30 градусах Цельсия. Кроме того, инкубированная библиотека CDNA преобразовывала Y 187 в 20 миллилитрах клея YP в течение 10 минут при 30 градусах Цельсия с вращением. Затем центрифугируют объем PG BK T 7 трансформированной культуры AH 109, соответствующей эквивалентному количеству жизнеспособных дрожжевых клеток Y 187, в течение пяти минут при 3 500 об/мин и 20 градусах Цельсия.

Осторожно извлеките надосадочную жидкость и суспендируйте небо в 10 миллилитрах клея YP. Смешайте ресуспендированные дрожжи AH 109 с библиотекой, содержащей Y 187. Переложите в пробирку объемом 50 миллилитров перед центрифугированием в течение пяти минут при 3 500 об/мин и 20 градусах Цельсия.

После тщательного снятия супер дат Ресус, суспендируйте гранулу в клее YP, чтобы получить в общей сложности 1,5 миллилитров. Далее распределите дрожжи на три агара YCM, 150 миллиметровых пластин по 0,5 миллилитров на тарелку и инкубируйте 4,5 часа при температуре 30 градусов Цельсия. Соберите спаренные дрожжи с планшетов YCM путем соскабливания граблями стакана в 10 миллилитрах селективной выпадающей среды за вычетом лейцина, триптофана и гистидина.

Промойте планшет два раза пятью миллилитрами той же среды и после центрифугирования в течение пяти минут при 3 500 об/мин и 20 градусах Цельсия. Откажитесь от надосадочной жидкости и реуса. Суспендируйте дрожжевую гранулу в пяти миллилитрах селективной выпадающей среды за вычетом лейцина, триптофана и гистидина.

Затем распределите спаренные дрожжи на 10 тарелок селективного агара за выпадением лейцина, триптофана и гистамина с добавлением соответствующей концентрации трех или трех аминотриазолов, как определено в тесте на автоактивацию. Рассчитайте диплоидную норму, как описано в письменном протоколе, после инкубации при 30 градусах Цельсия во влажной атмосфере в течение шести-10 дней. Соберите колонии дрожжей и переложите в тарелки, приготовленные из селективного агара за вычетом лейцина, триптофана и гистидина плюс три та.

Заказывайте дрожжи по схеме из восьми дорожек по 12 лунок, воспроизводя 96 луночную пластину, чтобы потом было легче проводить секвенирование. Дайте колониям дрожжей расти в течение четырех-пяти дней при температуре 30 градусов Цельсия в увлажненной атмосфере. Целью данного раздела является ПЦР, амплификация КДНК, содержащихся в PA ct двух векторах лизированных колоний дрожжей, выращенных на селективных пластинах агара с выпадением лейцина, тритофана и гистидина.

Начните с помещения 96-луночного ПЦР-планшета на лед для лизирования дрожжевых клеток из расчета 50 микролитров на лунку раствора xmal 20 T. Аккуратно восстановите суспендию по одной колонии на лунку. Инкубируйте планшет 15 минут при 37 градусах Цельсия и 15 минут при 95 градусах Цельсия.

После того, как тарелка снова показалась на лед, добавьте 50 микролитров дистиллированной воды на лунку, перемешайте с помощью пипетирования вверх и вниз, и приступайте к центрифугированию в течение пяти минут при 3 500 об/мин и четырех градусах Цельсия. После приготовления смеси X tack, как описано в текстовом протоколе, распределите 40 микролитров смеси на лунку в 96-луночном ПЦР-планшете. Добавьте 10 микролитров лизированных дрожжей в лунку и выполните амплификацию, как указано в текстовом протоколе.

Нанесите три микролитра продуктов ПЦР на 1,2%-ный гель агрос, чтобы обнаружить клоны с положительным результатом ПЦР. Секвенирование с помощью ПЦР амплифицированных фрагментов выделено из трех его положительных клонов. Затем проведите бласт-анализ для идентификации клеточных открытых считывающих кадров, отбрасывая выравнивания с низкой достоверностью, а также сдвиг рамки и код преждевременной остановки на содержащих последовательностях перед трансфекцией клеток.

Перенос белка патогена и клеточного белка в соответствующие векторы для получения белков, слитых с фрагментами Gaia luciferaza, как описано в текстовом протоколе seed 2, 9 3 Т-клеток в концентрации 350 000 клеток на миллилитр DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой без антибиотика. Распределите 100 микролитров на лунку в стерильных белых культуральных планшетах перед выращиванием в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на следующий день. При трансфекции клеток с использованием любого подходящего протокола трансфекции используется 100 нанограмм на лунку как патогена, так и открытого считывающего каркаса, плазмидных конструкций трансфектируют 10 нанограммов на лунку плазмиды ЦМВ-светлячка люциферазы для нормализации эффективности трансфекции.

Каждая точка испытывается в тройном переносе трансфекционной смеси на планшеты культивируемых 2 9 3 Т-клеток. Будьте осторожны и аккуратно наносите смесь ДНК на клетки, так как 2, 9, 3 Т-клетки не обладают сильной адгезией и легко отделяются от дна лунки, инкубируйте в инкубаторе для клеточных культур в течение 24-30 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, промывайте клетки PBS со скоростью 100 микролитров на лунку. Добавьте 40 микролитров одного x ванильного лизиса, буферизируйте и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре.

При перемешивании сохраните 10 микролитров клеточных лизатов в другой белой пластине для последующей дозировки люциферазы светлячков, хранящейся при температуре 4 градуса Цельсия или при температуре минус 20 градусов Цельсия с потолком для измерения активности Гайи. Поместите планшет в люминометр и введите 100 микролитров реагента для анализа ванили люциферазы на клеточные лизаты. Затем посчитайте люминесценцию в течение 10 секунд.

Дозировка 96 луночной пластины занимает около получаса. Всегда используйте свежие экстракты, так как замораживание или длительное хранение может повлиять на опосредованную взаимодействием активность Gaia на оставшихся 10 микролитровых клеточных экстрактах. Введите 50 микролитров реагента для анализа люциферазы светлячков на клеточные лизаты с помощью люминометра и подсчитывая люминесценцию в течение 10 секунд.

Дозировка 96-луночного планшета занимает около получаса на каждое взаимодействие. Рассчитайте соотношение между активностью люциферазы Gaia и активностью люциферазы светлячков, чтобы получить нормализованное значение люминесценции GAIA. С учетом эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток.

Вычислите среднее значение троек для мониторинга взаимодействия. Оцените нормализованный коэффициент люминесценции или NLR для каждой пары патогенов-хозяев. Для этого нормализованную люминесцентную активность GAIA, обнаруженную в присутствии как патогенных, так и принимающих белков, можно разделить на сумму активностей, измеренных в контрольных лунках.

В предыдущем исследовании пороговое значение NLR для положительных взаимодействий оценивалось примерно в 3,5. Основное преимущество высокопроизводительных рецептов GIA, анализа комплементации белков, или H-T-G-P-C-A, заключается в его высокой чувствительности, что иллюстрируется оценкой ложноположительных и ложноотрицательных показателей для второго белка HPVE для определения частоты ложноотрицательных результатов. Известные взаимодействия Е-2 из ВПЧ-16 оценивались с помощью H-T-G-P-C-A. Четыре из 18 взаимодействий не были восстановлены, что соответствует частоте ложноотрицательных результатов 22%.

Количество ложноположительных взаимодействий составило 5,8% с использованием 12 белков HPVE two против случайного набора клеточных белков. Сильная специфичность метода показана на этом рисунке, показывающем, что одноточечная мутация, которая, как известно, препятствует связыванию E two с его клеточным партнером BRD 4, аннигилирует отношение NLR. Этот широкомасштабный сравнительный эктомический подход был недавно успешно применен к трем ранним белкам вирусов папилломы человека, E two, E six и E seven, происходящим из разных генотипов, что отражает их естественное разнообразие в тропизмах и патологиях для каждого из ранних белков.

Иерархическая кластеризация профилей взаимодействий в основном повторяет филогению ВПЧ, доказывая надежность подхода и количество наборов данных о взаимодействии. Он может быть использован для корреляции специфических профилей взаимодействия вируса с патологическими признаками, тем самым давая подсказки об участии вирусных белков. В патогенезе могут быть выделены генотип-специфические взаимодействия, которые потенциально соответствуют тропизму или патогенным биомаркерам.

Как показано на рисунке для шести взаимодействующих партнеров, клеточные мишени были отсортированы на основе интенсивности взаимодействия и сгруппированы в соответствии с типом взаимодействующего ВПЧ. Такое представление позволяет идентифицировать специфические биомаркеры, такие как fad, который взаимодействует только с белками Е-6 онкогенного ВПЧ. Такое нацеливание должно иметь решающее значение для канцерогенного признака всех онкогенных ВПЧ и, таким образом, является хорошим кандидатом для использования либо в качестве суррогатного маркера ВПЧ-инфекции, либо в качестве терапевтической мишени.

Следуя этой процедуре. H-T-G-P-C-A может быть адаптирован для использования с третьим белком, экспрессируемым в виде слияния с меткой биотина. Это позволяет захватывать три партнерских комплекса на цветных пластинах стрептококкового дайвинга, и это может ответить на вопрос об образовании крупных белковых комплексов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как охарактеризовать патоген, взаимодействие хозяина с горшком. В-третьих, путем зондирования партнеров по взаимодействию нескольких вариантов штаммов. Во-вторых, путем сравнения их взаимодействия с целым набором типов патогенов с использованием длительности белка белка, скажем, в клетках млекопитающих.