Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Общая цель следующего эксперимента заключается в проведении эктомических исследований для сравнения профилей взаимодействия белков различных вариантов патогена с общим набором клеточных факторов. Это достигается путем проведения дрожжевого двухгибридного скрининга кДНК на основе спаривания для идентификации потенциальных партнеров по взаимодействию белков различных вариантов патогена. На втором этапе открытые рамки считывания взаимодействующих партнеров секвенируются и переносятся в векторы, совместимые с дальнейшей валидацией.

Затем набор отдельных партнеров, выявленных в обоих гибридных скринингах, отбирается и подвергается повторному тестированию на взаимодействие с полным спектром исследуемых штаммов. Это осуществляется с помощью ортогонального анализа gia — метода комплементации фрагментов белков на основе люциферазы, проводимого в клетках млекопитающих для получения надежных сравнительных наборов данных о взаимодействиях. Результаты, основанные на показателях люциферазы, демонстрируют различную интенсивность взаимодействий между белками патогена и клеточными белками, обеспечивая таким образом сравнительный обзор белок-белковых взаимодействий между патогеном и хозяином.

Обработка профилей взаимодействия с помощью иерархической кластеризации позволяет сопоставить специфические взаимодействия патогена с хозяином с патологическими признаками и дает представление о роли белков патогена в патогенезе. Основным преимуществом данного подхода перед другими методами картирования белок-белковых взаимодействий между патогеном и хозяином является получение строгого сравнительного набора данных о взаимодействиях между множеством вариантов штаммов. Этот метод позволяет изучить сеть взаимодействий белка патогена, но его также можно применить к другим системам с использованием инфекционных молекул, например, целых вирусов и обратной генетики. Начните выполнение данного протокола со скрещивания и посева дрожжевых клеток, как описано в текстовом протоколе по посеву.

30 мл селективной среды с выпадением триптофана, содержащей несколько колоний дрожжевого штамма AH 1 0 9, трансформированного плазмидой P-G-B-K-T семь, экспрессирующей белок патогена. Инкубировать в течение 30 часов при 30 °C с перемешиванием. Затем в 200 мл селективной среды без триптофана внести 30 мл культуры AH 1 0 9.

Культуры инкубируют с перемешиванием в течение 20 часов при 30 °C. Также инкубируют трансформированные кДНК-библиотекой клетки Y 187 в 20 мл среды YP-glue в течение 10 минут при 30 °C с перемешиванием. Затем центрифугируют объем культуры AH 109, трансформированной pGBKT7, соответствующий эквивалентному количеству жизнеспособных дрожжевых клеток Y 187, в течение пяти минут при 3 500 об/мин и 20 °C.

Осторожно отберите супернатант и ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах YP-клея. Смешайте ресуспендированные дрожжи AH 109 с библиотекой в Y 187. Перенесите смесь в пробирку объемом 50 миллилитров, затем центрифугируйте в течение пяти минут при 3 500 RPM и 20 °C.

После осторожного удаления супернатанта Resus, ресуспендируйте осадок в клее YP до общего объема 1,5 миллилитров. Затем распределите дрожжи по трем чашкам с агаром YCM диаметром 150 миллиметров из расчета 0,5 миллилитров на чашку и инкубируйте 4,5 часа при 30 °C. Соберите спарившиеся дрожжи с чашек YCM, соскребая их стеклянным скребком в 10 миллилитров селективной среды с выпадением лейзина, триптофана и гистидина.

Промойте планшет дважды пятью миллилитрами той же среды и объедините фракции после центрифугирования в течение пяти минут при 3, 500 RPM и 20 градусов Цельсия. Удалите супернатант и повторите процедуру. Ресуспендируйте осадок дрожжей в пяти миллилитрах селективной среды с отсутствием лейцина, триптофана и гистидина.

Затем распределите спаренные дрожжи по 10 чашкам с селективным синтетическим агаром без лейцина, триптофана и гистидина, дополненным соответствующей концентрацией 3-амино-1,2,4-триазола (3-AT), определенной в тесте на автоактивацию. Рассчитайте частоту образования диплоидов согласно письменному протоколу после инкубации при 30 °C в увлажненной атмосфере в течение 6–10 дней. Отоберите колонии дрожжей и перенесите их на свежеприготовленные чашки с селективным синтетическим агаром без лейцина, триптофана и гистидина с добавлением 3-AT.

Расположите дрожжи по схеме из восьми рядов по 12 лунок, имитирующей 96-луночный планшет, чтобы в дальнейшем упростить секвенирование. Инкубируйте дрожжевые колонии в течение четырех-пяти дней при 30 °C в условиях повышенной влажности. Целью данного этапа является ПЦР-амплификация кДНК, содержащейся в векторах PA ct two лизированных колоний дрожжей, выращенных на селективном среде-агаре с отсутствием лейцина, триптофана и гистидина.

Начните с размещения 96-луночного PCR-планшета на льду; для лизиса дрожжевых клеток добавьте в каждую лунку по 50 µL раствора xmal 20 T. Осторожно ресуспендируйте по одной колонии в каждой лунке. Инкубируйте планшет 15 минут при 37 °C и 15 минут при 95 °C.

После того как планшет снова будет помещен на лед, добавьте в каждую лунку по 50 µL дистиллированной воды, перемешайте путем пипетирования, а затем центрифугируйте в течение пяти минут при 3 500 RPM и температуре 4 °C. После приготовления смеси X tack, как описано в текстовом протоколе, распределите по 40 µL смеси в каждую лунку 96-луночного PCR-планшета. Добавьте по 10 µL лизированных дрожжей в каждую лунку и проведите амплификацию согласно текстовому протоколу.

Нанесите три микролитра ПЦР-продуктов на 1,2% агарозный гель для выявления ПЦР-положительных клонов. Проведите секвенирование ПЦР-амплифицированных фрагментов, выделенных из трех положительных клонов. Затем выполните blast-анализ для идентификации клеточных открытых рамок считывания, отсеивая выравнивания с низкой достоверностью, а также последовательности, содержащие сдвиг рамки считывания или преждевременные стоп-кодоны, перед трансфекцией клеток.

Перенесите открытые рамки считывания белка патогена и клеточного белка в соответствующие векторы для получения белков, слитых с фрагментами люциферазы Gaia, как подробно описано в текстовом протоколе. Высейте клетки seed 2 9 3 T с плотностью 350 000 клеток на миллилитр DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки без антибиотиков. Разлейте по 100 мкл в каждую лунку стерильных белых культуральных планшетов перед инкубацией в течение 24 часов при 37 °C с 5% carbon dioxide. На следующий день проведите трансфекцию клеток, используя любой подходящий протокол трансфекции; используйте по 100 нг на лунку плазмидных конструкций с открытыми рамками считывания патогена и хозяина. Трансфицируйте 10 нг на лунку плазмиды CMV с люциферазой светлячка для нормализации эффективности трансфекции.

Каждую точку тестируют в трех повторностях, перенося смесь для трансфекции в планшеты с культивируемыми клетками 2 9 3 T. Осторожно наносите смесь ДНК на клетки, так как клетки 2 9 3 T обладают слабой адгезией и легко отделяются от дна лунки; инкубируйте в инкубаторе для культур клеток от 24 до 30 часов при 37 °C в атмосфере 5% carbon dioxide. Промойте клетки PBS в объеме 100 µL на лунку. Добавьте 40 µL 1x vanilla lysis buffer и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.

При перемешивании перенесите 10 µL клеточных лизатов в другой белый планшет для последующего определения активности люциферазы светлячка, хранящегося при 4 °C или, в качестве альтернативы, при -20 °C, чтобы измерить активность Gaia. Поместите планшет в люминометр и внесите 100 µL реагента для анализа люциферазы в клеточные лизаты. Затем измерьте люминесценцию в течение 10 секунд.

Дозирование в 96-луночный планшет занимает около получаса. Всегда используйте свежеприготовленные экстракты, так как замораживание или длительное хранение могут повлиять на опосредованную взаимодействием активность Gaia в оставшихся 10 µL клеточных экстрактов. С помощью люминометра внесите 50 µL реагента для анализа люциферазы светлячка в клеточные лизаты и измеряйте люминесценцию в течение 10 секунд.

Дозирование в 96-луночный планшет занимает около получаса для каждого взаимодействия. Рассчитайте соотношение активности люциферазы Gaia и активности люциферазы светлячка, чтобы получить нормализованное значение люминесценции GAIA, учитывая эффективность трансфекции и жизнеспособность клеток.

Вычислите среднее значение для трех повторностей, чтобы отслеживать взаимодействие. Рассчитайте нормализованное соотношение люминесценции или NLR для каждой пары «патоген-хозяин». Для этого разделите нормализованную люминесцентную активность GAIA, обнаруженную в присутствии белков патогена и хозяина, на сумму активностей, измеренных в контрольных лунках.

В предыдущем исследовании было установлено, что пороговое значение NLR для положительных взаимодействий составляет примерно 3.5. Основным преимуществом метода высокопроизводительного анализа GIA, анализа КОМПЛЕМЕНТАЦИИ белков или H-T-G-P-C-A, является его высокая чувствительность, что подтверждается оценкой частоты ложноположительных и ложноотрицательных результатов для белка E2 HPV для определения частоты ложноотрицательных результатов. При анализе известных взаимодействий белка E2 из HPV 16 методом H-T-G-P-C-A четыре из 18 взаимодействий не были обнаружены, что соответствует частоте ложноотрицательных результатов 22%.

Доля ложноположительных взаимодействий составила 5.8% при тестировании 12 белков HPVE E2 с набором случайных клеточных белков. Высокая специфичность метода подчеркивается на данном рисунке, где показано, что одиночная точечная мутация, которая, как известно, препятствует связыванию E2 с его клеточным партнером BRD4, сводит коэффициент NLR к нулю. Этот крупномасштабный сравнительный эктомный подход был недавно успешно применен к трем ранним белкам вирусов папилломы человека — E2, E6 и E7, полученным из различных генотипов, представляющих их естественное разнообразие по тропизму и патологиям для каждого из ранних белков.

Иерархическая кластеризация профилей взаимодействий в основном повторяет филогению HPV, что подтверждает надежность данного подхода и универсальность наборов данных о взаимодействиях. Этот метод может быть использован для корреляции специфических профилей взаимодействия вируса с хозяином с патологическими признаками, что дает представление о роли вирусных белков. В контексте патогенеза могут быть выделены специфические для генотипа взаимодействия, которые потенциально соответствуют тропизму или патогенным биомаркерам.

Как показано здесь для шести взаимодействующих партнеров E6, клеточные мишени были отсортированы по интенсивности взаимодействия и сгруппированы в соответствии с взаимодействующим типом ВПЧ. Такое представление позволяет идентифицировать специфические биомаркеры, такие как fad, который взаимодействует только с белками E6 онкогенных ВПЧ. Подобное воздействие должно иметь решающее значение для канцерогенных свойств всех онкогенных ВПЧ и, таким образом, является подходящим кандидатом для использования либо в качестве суррогатного маркера инфекции ВПЧ, либо в качестве терапевтической мишени.

После выполнения данной процедуры метод H-T-G-P-C-A может быть адаптирован для использования с третьим белком, экспрессированным в виде слияния с биотиновым тегом. Это позволяет захватывать три партнерских комплекса на планшетах с стрептавидином, что дает возможность ответить на вопрос о формировании крупных белковых комплексов.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как характеризовать взаимодействия между патогеном и хозяином: во-первых, путем анализа партнеров по взаимодействию для нескольких вариантов штаммов; во-вторых, путем сравнения их взаимодействия с целым набором типов патогенов с использованием метода определения белок-белкового взаимодействия, например, в клетках млекопитающих.