Генетических манипуляций мышью Разработка Гипоталамус через

Общая цель данной процедуры заключается в трансфекции плазмидной ДНК в гипоталамус эмбрионов мыши, развивающихся в матке, для активации или репрессии функции интересующего гена. Это достигается путем предварительного наркоза беременной мыши и обнажения матки посредством лапаротомии. Вторым этапом является введение раствора ДНК в третий желудочек головного мозга эмбриона.

Затем положительный электрод помещают внутрь матки между плацентой и головой эмбриона. Отрицательный электрод размещают на внешней поверхности матки, после чего подают электрические импульсы. Заключительным этапом является извлечение трансфицированного мозга эмбрионов через шесть дней.

В конечном итоге флуоресцентная микроскопия используется для анализа фенотипических изменений трансфицированных клеток: их количества, формы, положения, экспрессии маркеров и так далее. Основными преимуществами данного метода по сравнению с существующими способами, такими как вирусная трансфекция, являются, во-первых, отсутствие необходимости в специальных мерах предосторожности и наличии двух специализированных помещений; во-вторых, возможность воздействия на конкретную область; и в-третьих, более высокая скорость скрининга генов-кандидатов при использовании электропорации.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку введение раствора ДНК в третий желудочек и правильное позиционирование иглы-электрода требуют развитой мануальной ловкости и определенного опыта. Этот метод позволяет ответить на вопросы в области развития гипоталамуса, особенно те, которые касаются миграции клеток, а также генетической спецификации отдельных областей и ядер. Начните выполнение данной процедуры с вытягивания высококачественных стеклянных микропипеток, так как они необходимы для снижения высокого начального процента потерь эмбрионов из-за утечки амниотической жидкости.

Для подготовки ДНК растворите очищенную плазмидную ДНК, не содержащую эндотоксинов, в PBS с добавлением 0,1% fast green до конечной концентрации 1–2 мкг/мкл. Fast green сделает вводимый раствор видимым в желудочке эмбрионального мозга. Затем заберите 10 мкл раствора ДНК в стеклянную микропипетку.

Затем подключите стеклянную микропипетку к системе инъекций или используйте ротовую пипетку. На этом этапе подготовьте хирургический стол с нагревательной подушкой и хирургические инструменты. Включите источники холодного света для облегчения визуализации эмбрионов. Затем продезинфицируйте хирургические инструменты с помощью стеклянного бисерного стерилизатора.

Затем проведите анестезию беременной мыши с помощью изофлурана. После введения животного в состояние наркоза нанесите на глаза мазь для предотвращения пересыхания. После этого закрепите маску на морде животного для поддержания непрерывной анестезии.

Теперь поместите мышь на грелку брюшной стороной вверх. Зафиксируйте тело, прикрепив все четыре конечности с помощью лейкопластыря. Убедитесь, что животное полностью находится под воздействием анестезии, сжав хвост для проверки рефлексов.

Затем выбрейте шерсть на поверхности живота и продезинфицируйте её раствором йода. Сделайте продольный разрез длиной примерно от одного до полутора сантиметров на коже живота. После этого рассеките брюшину.

Затем поместите вокруг разреза хлопковую марлю. Промойте марлю раствором PBS. Обнажите один рог матки, аккуратно вытянув его тупыми пинцетом.

Избегайте сильного натяжения миометрия или матки. Высокое давление внутри матки повышает вероятность вытекания жидкости с эмбрионом при инъекции, что может привести к аборту. Затем поместите рог матки на марлю, промытую раствором PBS, и промывайте его раствором PBS каждые несколько минут для поддержания увлажненности.

Теперь под микроскопом удерживайте матку таким образом, чтобы были видны желудочки мозга. Не пытайтесь существенно переместить эмбрион, если он находится в неудобном положении. Это лишь увеличит вероятность выкидыша.

Посмотрите на голову эмбриона сверху, чтобы найти зазор, представляющий собой щель между левым и правым полушариями коры головного мозга. Полушария легко различимы, а боковые желудочки внутри них обычно воспринимаются как более темные области. Если эмбрион ориентирован оптимально для инъекции ДНК, можно проколоть стенку матки и сразу ввести иглу в третий желудочек.

Держите стеклянную микропипетку с предварительно подготовленной ДНК под углом 45 градусов к стенке матки и проколите её в ростральном конце межполушарной щели, погрузившись примерно на одну миллиметр вглубь. Таким образом кончик стеклянной микропипетки попадет в третий желудочек мозга, а не в боковой желудочек. Затем введите около одного микролитра раствора ДНК в третий желудочек; при успешной инъекции желудочек заполнится зеленой жидкостью. Повторите ту же процедуру для всех эмбрионов того же рога матки.

Это даст время для равномерного смешивания раствора ДНК с желудочковой жидкостью и его проникновения во весь нейроэпителий. Теперь включите электропоратор и настройте параметры в соответствии с эмбриональным возрастом. В качестве положительного полюса используйте игольчатый электрод из нержавеющей стали, а в качестве отрицательного — круглый плоский электрод; для электропорации выбирайте эмбрионы, расположенные дорсальной стороной вверх.

Затем проколите стенку матки рядом с головой эмбриона между амниотическим мешком и плацентой, продвинув кончик игольчатого электрода вниз сквозь нее. В качестве упора используйте указательный палец другой руки. Примерно 5 mm кончика электрода должны находиться между амниотическим мешком и стенкой матки примерно на уровне среднего мозга.

Поскольку этот электрод является направляющим, его положение определит, какая часть нейроэпителия гипоталамуса с наибольшей вероятностью подвергнется трансфекции. Затем другой рукой поместите круглый плоский электрод снаружи стенки матки с противоположной стороны от головы эмбриона. После этого осторожно зажмите эмбрион между электродами.

Используйте ножной переключатель для подачи напряжения. После этого медленно извлеките иглообразный электрод из матки, придерживая матку указательным пальцем другой руки. Если через прокол в стенке произойдет истечение амниотической жидкости, обычно наступает аборт эмбриона.

После инъекции и электропорации всех эмбрионов очень осторожно верните матку в брюшную полость мыши, расположив ее точно так же, как она находилась изначально. Затем, перед закрытием, увлажните брюшную полость физиологическим раствором. Зашейте брюшину хирургическим кетгутом, после чего зашейте кожу более прочной нитью.

Дезинфицируйте поверхность живота раствором йода и подкожно введите нестероидный противовоспалительный препарат для облегчения боли. Затем снимите самку с аппарата для наркоза и поместите ее в клетку, подогреваемую грелкой. Наблюдайте за мышью до полного выхода из наркоза и проводите ежедневные осмотры, чтобы убедиться, что восстановление после процедуры проходит без признаков инфекции или боли.

На данном этапе выделите эмбрионы или постнатальных особей в соответствии с выбранным днем анализа. Отберите эмбрионы, в которые была введена ДНК и проведена электропорация, и препарируйте головной мозг под данным стереомикроскопом. Затем проверьте наличие сигнала зеленой флуоресценции в соответствующей области.

Для анализа мозга выбранного эмбриона зафиксируйте ткань в течение короткого времени в 4% паральдегиде. Затем включите её в 4% агар или желатин-альбумин. После этого выполните срезы мозга на вибротоме.

На этих рисунках представлен гипоталамус после внутриутробной трансфекции плазмидной ДНК, несущей флуоресцентные репортерные гены GFP или CFP, на стадии E 12.5. Это сагиттальный срез, демонстрирующий гипоталамус, трансфецированный от рострального до каудального конца; здесь же представлен поперечный срез с мечеными клетками на разных уровнях вдоль медиолатеральной оси. Данный сагиттальный срез показывает специфически трансфецированное маммиллярное тело и метку его характерного аксонального дерева, а на правой стороне этого поперечного среза видна меченая полоса, соответствующая нейронам, рожденным на стадии E 12.5.

Для более детального анализа срезов были подготовлены горизонтальные срезы, параллельные плоскости радиальных глиальных отростков, исходящих из маммиллярного рецессуса. Нейроны ambi O, возникшие из нейроэпителия, трансфицированного на день E 12.5, были идентифицированы на день E 18.5 с помощью антител к GFP.

В данном примере антитело маркировало ограниченную группу клеток MBO. Эта группа располагалась между двумя немаркированными латеральной и медиальной областями MBO, соответствующими нейронам MBO, которые образовались до и после E 12.5, и совместным окрашиванием антителом против neston. Красным цветом показан способ миграции индивидуально маркированных нейронов по отросткам радиальной глии нейроэпителия. После освоения эта техника занимает 30 минут при условии правильного выполнения.

После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как вводить ДНК в третий желудочек и как расположить иглу в качестве положительного электрода между эмбрионом, головой и плацентой для эффективного воздействия на гипоталамус. После проведения этой процедуры можно применить другие методы, такие как иммуногистохимия или гибридизация in situ, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о фенотипе трансфицированных нейронов.