Генетических манипуляций мышью Разработка Гипоталамус через В утробе матери Электропорацию

Общая цель этой процедуры заключается в трансфекции плазменной ДНК в гипоталамус эмбрионов мышей, развивающихся внутриутробно, с целью активации или подавления функции интересующего гена. Это достигается путем предварительной анестезии беременной мыши и обнажения матки с помощью лапаротомии. Второй шаг заключается во введении раствора ДНК в третий желудочек эмбрионального мозга.

Далее положительный электрод располагается внутри матки между плацентой и головкой эмбриона. Отрицательный электрод помещается на наружную поверхность матки и на него подаются электрические импульсы. Последним шагом является удаление трансфицированного эмбрионального мозга через шесть дней.

В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для анализа фенотипических изменений трансфицированных клеток, количества, формы, положения, экспрессии маркеров и так далее. Основные преимущества этой методики перед существующими методами вроде вирусной трансфекции заключаются в том, что, во-первых, она не требует особых мер предосторожности, а так как объектов два, то во-вторых, возможно нацеливание на конкретный регион. И, в-третьих, с помощью электропорации Ute скрининг генов-кандидатов происходит быстрее.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что введение раствора ДНК в третий желудочек и правильное позиционирование игольчатого электрода требуют продвинутого ручного перекоса вместе с некоторым опытом. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области развития гипоталамуса, особенно те, которые имеют отношение к миграции клеток, а также к тому, как отдельные области и ядро генетически специфицированы. Начните эту процедуру с использования стеклянных микропипеток хорошего качества, так как они необходимы для снижения первоначальной высокой частоты абортов из-за потери амниотической жидкости.

Для получения ДНК растворяют очищенную свободную ДНК эндотоксина плазмы в PBS, содержащую 0,1% быстрого зеленого цвета, до конечной концентрации от одного до двух микрограммов на микролитр. Быстрый зеленый цвет сделает введенный раствор видимым в эмбриональном желудочке мозга. Далее загрузите 10 микролитров раствора ДНК в стеклянную микропипетку.

Затем подсоедините стеклянную микропипетку к системе для инъекций или ротовой пипетке. На этом этапе подготовьте операционный стол с помощью грелки и хирургических инструментов Включите источники холодного света, чтобы облегчить визуализацию эмбрионов. Затем продезинфицируйте хирургические инструменты с помощью стерилизатора со стеклянными шариками.

Далее обезболите беременную мышь изофтором. После того, как мышь прошла обезболивание, нанесите мазь на ее глаза, чтобы предотвратить высыхание. Впоследствии наденьте маску на лицо, чтобы поддерживать анестезию непрерывно.

Теперь поместите мышь на грелку брюхом вверх. Закрепите его тело на месте, зафиксировав четыре конечности скотчем. Убедитесь, что мышь полностью обезболивается, ущипнув ее за хвост для рефлюкса.

Затем побрейте брюшную поверхность и продезинфицируйте ее раствором йода. Сделайте продольный разрез длиной от одного до полутора сантиметров на коже живота. После этого разрежьте брюшину.

Далее поместите ватную марлю вокруг разреза. Промойте марлю с помощью PBS. Обнажите один маточный рог, осторожно вытащив его тупыми щипцами.

Избегайте туго вытягивания миометрия или матки. Так как высокое давление внутри матки увеличивает вероятность потери жидкости эмбриона при инъекции, что приводит к аборту. Затем поместите маточный рог на полоскаемую марлю PBS и промывайте его PBS каждые несколько минут, чтобы он оставался влажным.

Теперь под микроскопом подержите матку таким образом, чтобы можно было визуализировать желудочки мозга. Не следует чрезмерно перемещать эмбрион, который находится в неблагоприятном положении. Это только увеличивает шансы на прерывание беременности.

Посмотрите на голову эмбриона сверху, чтобы найти щель между левым и правым корковыми полушариями. Полушария легко различимы, а боковые желудочки внутри них обычно можно воспринимать как несколько более темные формы. Если будет обнаружено, что эмбрион идеально ориентирован для введения ДНК, есть возможность проколоть стенку матки и попасть сразу в третий желудочек.

Поднесите стеклянную микропипетку с подготовленной ранее ДНК под углом 45 градусов к стенке матки и проколите ее на ростральном конце межполушарной щели, проникая на глубину около одного миллиметра. Таким образом, кончик стеклянной микропипетки будет попадать в третий желудочек мозга, а не в латеральный желудочек. После того, как ввести около одного микролитра раствора ДНК в третий желудочек, зеленая жидкость заполнит желудочек хорошей инъекцией, повторить ту же процедуру со всеми эмбрионами одного и того же рога матки.

Это даст некоторое время раствору ДНК равномерно смешаться с желудочковой жидкостью и достичь всего нейроэпителия. Теперь включите электропертер и отрегулируйте настройки в соответствии с возрастом эмбриона. Используйте игольчатый электрод из нержавеющей стали в качестве положительного полюса и круглый плоский электрод в качестве отрицательного полюса, выберите эмбрионы тыльной стороной вверх для электропорации.

Затем проколите стенку матки рядом с головой эмбриона между амниотическим мешком и плацентой, просунув через нее вниз кончик игольчатого электрода. Затем используйте указательный палец другой руки в качестве колющего блока. Около пяти миллиметров кончика электрода должно находиться между амниотическим мешком и стенкой матки примерно на уровне среднего мозга.

Поскольку этот электрод является целевым, его положение определит, какая часть нейроэпителия гипоталамуса с наибольшей вероятностью будет трансфицирована. Затем другой рукой расположите круглый плоский электрод за пределами стенки матки на противоположной стороне головы эмбриона. Затем аккуратно выдавите эмбрион между электродами.

Используйте педальный переключатель для подачи напряжения. После этого медленно вытяните игольчатый электрод из матки, удерживая при этом матку указательным пальцем другой руки. Если амниотическая жидкость теряется через проколотую стенку, обычно эмбрион подвергается аборту.

После инъекции и электропорации всех эмбрионов очень осторожно поместите матку обратно в брюшную полость мыши и расположите их точно так же, как они были раньше. Затем смочите брюшную полость солевым раствором перед ее закрытием. Зашить брюшину хирургическим кошачьим кишком, затем зашить кожу более стойким швом.

Продезинфицируйте поверхность живота раствором йода и введите нестероидное противовоспалительное средство подкожно для облегчения боли. Далее извлеките маму из наркозного аппарата и поместите ее в клетку, которая нагревается грелкой. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от анестезии, и ежедневно проверяйте ее, чтобы убедиться, что она восстанавливается после процедуры без каких-либо признаков инфекции или боли.

На этом этапе соберите эмбрионы или постнатальные эмбрионы в соответствии с желаемым днем анализа. Выберите эмбрионы, которые были введены с помощью ДНК и электропорированы, и препарируйте мозг под этим стереомикроскопом. Затем проверьте наличие зеленого флуоресцентного сигнала в соответствующей области.

Чтобы проанализировать мозг выбранного эмбриона, зафиксируйте ткань на короткое время в 4%-ном паральдегиде. Далее заделите его в арос 4% или в желатин альбумин. Затем разделите мозг на вибрато.

Эти рисунки показывают гипоталамус после внутриутробной трансфекции плазменной ДНК, несущий флуоресцентные репортерные гены, GFP или CFP при E 12,5. Это сагиттальный срез, показывающий гипоталамус, трансфицированный из рострального в узелый, а вот поперечный срез с мечеными клетками на разных уровнях вдоль медиа-латеральной оси. На этом сагиттальном срезе показано специфически трансфицированное тело молочной железы и маркировка его характерного аксонального дерева, а на стороне электропарада этого поперечного среза показана помеченная полоса, соответствующая нейронам, рожденным на Е 12.5.

Разберем разделы поближе. Подготовлены горизонтальные срезы, параллельные плоскости радиальных глиальных отростков, исходящих из маммиллярного углубления. Нейроны ambi O, рожденные из нейроэпителия, трансфицированного на 12,5-й день Е, были идентифицированы на 18,5-й день Е с помощью антител против GFP.

В этом примере антитело помечало ограниченную группу клеток MBO. Эта группа была расположена между двумя немечеными латеральными и медиальными областями MBO, соответствующими нейронам MBO, рожденным до и после E 12.5, и совместному окрашиванию антителом против нестона. Красным цветом показан режим миграции индивидуально помеченных нейронов на радиальных глиальных отростках нейроэпителия После освоения этой техники ее можно выполнить за 30 минут при правильном выполнении.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вводить ДНК в третий желудочек и как расположить иглу в качестве положительного электрода между эмбрионом, головой и плацентой, чтобы эффективно воздействовать на гипоталамус. Следуя этой процедуре. Другие методы, такие как иммуногистохимия или инидная гибридизация, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о фенотипе трансфицированных нейронов.